作者  HIbaby (嗨北鼻)                                      看板  Biotech     
 標題  螢光免疫染色                                                           
 時間  Mon Nov 15 21:26:14 2004                                               
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※ 引述《aggaci (五子棋啦)》之銘言：
: ※ 引述《fjubiology (懷念簡郁書概論   )》之銘言：
: :      根據我的觀察其實還漫慢的
: :      不過我得先做movement
: :      可以每格10到20秒連續拍照觀察其運動速率。
:   可是物鏡頂多只到100x
:   要怎麼看的到清楚的mitochondria??


  請問一下 利用抗體做螢光免疫觀察 要怎樣提高良好的訊號
  比方說 該亮的要亮  背景就是背景?

  前一陣子 不斷的一抗二抗泡 才增加點靈敏度 但這應該不是辦法..-_-;;

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作者: keku (月光下輕舞) 看板: Biotech
標題: Re: 螢光免疫染色
時間: Mon Nov 15 22:47:39 2004

※ 引述《HIbaby (嗨北鼻)》之銘言：
: :   可是物鏡頂多只到100x
: :   要怎麼看的到清楚的mitochondria??
:   請問一下 利用抗體做螢光免疫觀察 要怎樣提高良好的訊號
:   比方說 該亮的要亮  背景就是背景?
:   前一陣子 不斷的一抗二抗泡 才增加點靈敏度 但這應該不是辦法..-_-;;

   提高訊雜比或噪訊比(Signal to Noise ratio)是很tricky的問題

   螢光顯微術在硬體上、軟體上有些方法可以做enhance    在此先不贅述

   針對抗體染色  最常碰到染不好的原因就是

   1. Wash不夠乾淨  使得溶液中有點晦晦亮亮的

   2. 抗體的specificity不夠好  亂黏東西以致於非target也會出現訊號

   3. 染色時間不恰當   染太快會降低螢光訊號   染太久會讓抗體亂黏

   其中第2和第3點    個人的經驗是會特別take care在1抗上

   比起來2抗的性質比較不會bind到unwanted target

   關於此類specificity的問題    適當的blocking步驟可以改善許多

   至於用以block的蛋白和濃度也需要一些經驗

   胎牛血清蛋白(BSA)是用得最廣泛的   濃度常在2~5%   如果太濃的話

   可能aggregation到連抗體都會被遮住



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