EGFP should work with both fixations, at least in my hands.
try following conditions -
pure MeOH @ -20'C for 3 min
PBS to rehydrate the EGFP and also wash away remained MeOH
blocking with "PBS + 2% BSA + 0.2% TX-100" for 30 min
primary antibody ... etc.
* Additional permeating step is NOT required since you have detergent in
your blocking solution.
293T is not a good system doing immunofluorescence; you should consider
switching to other cell lines, if possibe.
※ 引述《charliehsu (快讓自己進入狀況)》之銘言：
: 吃光光....
: 看到有人在討論immunofluorescence的一些細節
: 我也想來問問幾個我遇到的問題
: 因為我用的細胞是293T 原本就不會貼的很緊 用PBS就可以沖下來
: 我們實驗室在固定細胞的時候是用100%的 Methanol
: 加入五分鐘後吸乾並用PBS wash 兩次後再打洞
: 這樣可以讓細胞固定的很牢
: 可是如果我的細胞已經有transfection EGFP 或是DsRED
: 就不能用Methanol 因為會使EGFP不亮
: 我試過用2% formaldehyde 固定20分鐘
: 可是293T細胞感覺固定的並不是很好 常常wash幾次後細胞就...不見了 囧
: 即使在seeding細胞前先用FBS把dish或是cover slide 先coding過還是一樣
: 我也試過先用2% formaldehyde 固定20分鐘後 再用100%的 Methanol固定五分鐘
: 這樣細胞會牢 可是對EGFP的亮度依然有影響...
: 不知道板上的各位高手們有什麼好方法嗎?
: 可以讓細胞固定的牢又不會讓EGFP不亮...
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