推 ccfccf:寫的很用心喔 而且沒有錯別字 有m的潛力 10/23 22:25
推 cloudy1205:寫的真的好詳細，非常謝謝你^^ 10/24 01:17
推 greenmoon00:push 10/24 15:11
如果是一般的immunostain
我們做的方式大概是:
例如使用貼附性的細胞
1. 準備3cm culture dish
(或是12well盤也差不多只要可以容cover slide即可)
和蓋玻片cover slide (小小正方形那種)
2.在culture laminar flow 無菌操作台中
將一片cover slide 放入 一個dish或well中
3. 用100%EtOH wash 一次
即加入稍微沖洗 再吸出
4.在laminar flow 中風乾 及照UV
可放數小時或隔夜
5.將你要觀察的細胞 seeding種入
即加在已準備好的dish/slide上面
如貼附性細胞 培養隔夜 讓其貼在slide上面
6.將貼附好的細胞 拿出
吸掉medium 小心不要吸得太乾 避免細胞變形
7.加入固定buffer 可以參考paper 選用
我們是用3.7% formaldehyde in PBS or TBS/EDTA
此步驟可以放15min~數小時
8.吸掉固定buffer
加入permeablization buffer 將細胞打洞用
靜置1 min
3.7% formaldehyde
2% Triton-X 100 in PBS or TBS/EDTA
9. 吸掉buffer
加入2% albumin in PBS or TBS/EDTA
(如Western blocking的意思)
這步驟可放4度C冰箱 隔夜 注意不能讓細胞乾掉
到此 細胞算是處理好準備染色
10.吸乾buffer 加入你要染色的抗體
就像Western blot染1抗
先將抗體加入 2% albumin in PBS or TBS/EDTA
再均分到不同dish中
可以放4度C 4~5小時
每個小時可以拿出來稍微搖晃 注意不要乾掉
11.可用PBS or TBS/EDTA wash 3次
(例如加入1~2ml 稍微輕輕搖晃再吸出 這樣為一次wash)
12. 可依step 10.方式加入2抗
室溫下 1hr 大概每隔15~20分鐘輕輕搖晃
13. 再wash 1~2次
如要染細胞核 可在此步驟中
加入1~2ul DAPI 靜置1~3分鐘
再wash 1~2次
14.準備鑷子 和針頭
或是方便你挑起 cover slide的工具
最好是乾淨的或用酒精清潔過
準備 載玻片 並標示清楚
15.用pipet 滴 mounting solution 約30~40ul
(每一個slide 大概需要的量)
用針頭挑起染色好的slide
夾起cover slide反向蓋在 mountiing solution上面
__________________ cover slide
///////////////// 細胞
_______mounting solution____ 載玻片
16.放37度C 風乾1~2hr 就可以用顯微鏡看了
這樣應該可以對immunostain有點概念吧
希望有幫助摟
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我站在靠近天堂的頂端 張開手全部釋放 用月光取暖 給自己力量
才發現關於夢的答案 一直在自己手上 只有自己能 讓自己發光
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※ 編輯: Seal13 來自: 61.223.102.26 (10/23 21:07)