請問板上有做過Dual-luciferase reporter assay的先進們
小弟在實驗設計上遇到了一個問題，需要大家給點意見
---前情提要---
我們想要研究一個gene的promoter 找看看上面的TF binding site是否有function
於是我們就clone許多段deletion constructs
並將這些constructs接上pGL3這個 Luciferase reporter vector
之後將這些reporter constructs 分別與renilla transfect進cell中
此外，為了要看我們所預期的TF是否有作用
也同時co-transfect: pcDNA3、TF-1/pcDNA3、TF-1/pcDNA3 + TF-2/pcDNA3、TF-2/pcDNA3
為了讓大家更清楚看懂 大概是這樣設計的:
No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
renilla + + + + + + + + + + + + + + + +
pGL3 + + + +
Pro-1/pGL3 + + + +
Pro-2/pGL3 + + + +
pro-3/pGL3 + + + +
pcDNA3 + + + +
TF-1/pcDN3 + + + + + + + +
TF-2/pcDN3 + + + + + + + +
---本集重點---
就這樣...
我們照著promega給的protocol分別測出每一組的Luciferase 跟renilla的值
然後我們實驗室的算法是將每一組的Renilla值去除以"第一組"的Renilla值
得到一個倍率之後
再將每一組的Luciferase值去除以這個倍率
就等於該組normalized的Luciferase值
再將這個值去除以第一組的luciferase值得到一個fold (Luc. Related activity)
最後我們才將這個fold畫成圖
只是這樣的算法有個很大疑問
Q1: 就是pGL3 本身沒有promoter的時候應該不會有Luciferase activity
所以把第一組的luciferase當作分母是否恰當?
Q2: 請大家參考一下這篇paper的Fig4
http://www.jbc.org/cgi/content/full/281/43/32140
我們的情況就很像這個實驗
只是我研究了很久也不知道他們究竟是以什麼作為normalize的基準?
Q3: 大家做這類的functional assay是否會做一組沒有transfect的cell lysate
作為一個background值，並且在計算這些data的時候會去扣掉這些background值嗎?
簡單的說就是要如何normalization拉? orz
--
感謝大家撥冗看完我的疑問
希望有人看得懂我想問什麼
能不吝給我一點點建議與幫助
感激不盡
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 203.64.80.13