作者cloud74115 (阿亮)
看板Biotech
標題Re: [問題] pET expression vector的選定
時間Wed Mar 8 14:52:52 2006
空vector的有出來(GST 27 KD)
fusion的沒有出來(fusion protein 87 KD)
lysate的部份也有跑 可是一樣都沒有出來(可是空的pGEX有GST出來)
另外我induction的環境是
2 mL菌液overnoght, 隔天1:20 total 2 mL
refresh 養1~1.5小時, 0.1 mM IPTG 37度 3 hr
用50 uL B-per打破(有家protease inhibitors)
並且幾乎都是一天做到comassive染色
後來甚至還用GST抗體去抓(我的protein目前還沒有看到有賣抗體)
跑Western(有用空pGEX做control)
可是還是一樣沒有看到
所以才會打算要換系統是看看
目前是看中pET系統的 pET28a+
可是舊的pGEX還是會繼續screen
不知道各位有沒有什麼好建議
PS : 最近快做到瘋掉了 甚至有人說有沒有可能是分泌出來啦
但是我想這個應該不大可能吧 麻煩各位摟
※ 引述《liger.bbs@beta.life.nthu.edu.tw (還要在努力~~~)》之銘言：
: ※ 引述《cloud74115.bbs@ptt.cc (阿亮)》之銘言：
: > 之前將我的insert接到pGEX4T1這個vector
: > 定完序列也送到BL21作表現蛋白質
: > 同時也有做空pGEX4T1做control
: > 可是做了很久
: > 一直沒有看到我的fusion protein有被表現出來
: > 但是空的pGEX4T1卻明顯有出來
: > 和老師討論過後 老師也不知道為什麼會這樣
: > 所以後來決定要換套系統是看看
: > 現在想要看pET哪個vector最適合
: > 將insert這個protein純化出來後
: > 目的要做in vitro binding assay
: > 另外我的蛋白質是膜蛋白
: > 大概是1.6 bp
: 有induction出來嗎
: 有的話大概是因為不溶的關係吧 變成inclusion body了
: 如果induction不出來的話
: 可以試試看induction 時間加長 (at low temp, and low IPTG)
: Otherwise, you can just try another system, such as MBP, his-tag,
: or other new system like "Impact" (from invitrogen??).
: Good luck.
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◆ From: 163.15.174.98
推 ROKEE:那就胞外acetone沈澱阿，不過E. coli分泌系統很爛就是 03/08 15:19
推 ROKEE:小弟才疏學淺，偷問一下什麼是B-per? XDDD 03/08 15:21
推 enisx:是一種 protein extraction kit 03/08 17:05
推 blence:如果只要先確定有沒有表現，用PSB最快又方便了 03/08 18:27
→ blence:至少先知道是沒表現的問題,還是因為inclusion body的關係 03/08 18:32
推 cloud74115:謝謝大家喔 03/10 17:09