推 mournermind:謝謝啦~不過後來我放棄這個clone了 08/19 15:45
真巧，我最近也在處理一個 pET32 的 case
和你分享一下吧！
1. 首先確定你的 protein 屁股上真的掛著一個 His tag?
如果是我自己做的 clone，我會在 reverse primer 上掛著 stop codon
切掉 fusion partner 後就不會兩頭都帶有 His tag 了
2. 若真的兩頭都有 His tag
那麼還有一個 S tag 可以用來純化
如果你用 thrombin 切的話，S tag 會在你的 protein 那一邊
如果你用 enterokinase 切的話，S tag 就會在 fusion partner 那一邊
只有購買 S protein 就可以純化了
(目前知道 Novagen 在賣，也就是賣 pET32 的廠商啊)
※ 引述《mournermind (阿矇)》之銘言：
: 因為實在沒什麼頭緒想請有經驗的各位提供個想法
: 我現在要的蛋白接在pET32b中 想要利用它的trx來增加我蛋白的可溶性
: 表現後的確本來幾乎不可溶的蛋白(以前學姐做)變的是有部份可溶了
: 我現在想利用純化soluable protein的方式來純化出我要的蛋白
: 再將trx切掉得到較完整的我要的蛋白 但是由於以酵素切掉trx後
: His後所得到的proein帶有His tag而被切掉的trx上也帶有His tag
: 所以想問有經驗的學長姊們遇到這問題可以怎麼做呢?
: 我應該可以如何來將這兩個都帶有his的蛋白分開來咧@@?
: 真的是很想知道應該怎麼做 有辦法的人請給我一些指點 orz
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