推 ZecAhau:nt=nucleotide 140.109.224.35 12/13
推 coconutt:是Taq/Pwo polymwerase 150U 要價一萬 140.112.213.145 12/13
→ coconutt:所以我先測試看是否是其他的有問題 140.112.213.145 12/13
推 key:覺得貴 減少總體積省點錢吧 219.84.20.245 12/13
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作者 wensing (煉金術：等價交換) 看板 Biotech
標題 Re: 如何測試primer是否降解
時間 Mon Dec 13 02:24:35 2004
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※ 引述《coconutt (人活的快樂就好)》之銘言：
: 我的是DNA primer 約20nt
: 最近因為PCR都P不出來 所以在一項項確認
: 因為在兩個月前有P出來 但現在已經P了快一個月都沒有成果
: 所以想測試是否材料有問題
: 我的DNA的260/280偏低約1.6是否會是我P不出來的原因呢??但還是會有什麼不良影響呢?
: 因為我是自己看paper配lysis buffer 來打破癌細胞 只是每次真的不者麼純
: 已經抽了快10遍了 我只是抽total genomic DNA 而已
會不會是癌細胞會產生endonuclease？ (就像一些e. coli有endA+)
抽取的過程把genomic DNA給分解光光
(註：我不太懂癌細胞，好奇問一下)
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 211.74.6.12
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作者 julep.bbs@bbs.ccns.ncku.edu.tw (再混!你就倒大楣了), 看板 Biotech
標題 Re: 如何測試primer是否降解
時間 夢之大地 (Mon Dec 13 10:14:58 2004)
轉信 ptt!Group.NCTU!grouppost
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※ 引述《coconutt.bbs@ptt.cc (人活的快樂就好)》之銘言：
> 我的是DNA primer 約20nt
> 我的DNA的260/280偏低約1.6是否會是我P不出來的原因呢??但還是會有什麼不良影響呢?
> 因為我是自己看paper配lysis buffer 來打破癌細胞 只是每次真的不者麼純
> 已經抽了快10遍了 我只是抽total genomic DNA 而已
你要P的是genomic DNA嗎? 不是cDNA嗎?
如果是的話 genomic DNA本來就不好P
如果是要P cDNA 就抽RNA 做RT後再抽比較好
> 是否有人推薦哪一家的KIT好用 如果可以弄更純 有點想私下買來試試
> buffer是廠商附的 除了發霉 應該不會有問題吧
> 接著應該就是primer了 我曾經跑電泳過 沒有看到band 但我懷疑是量不夠多
primer很小 跑電泳本來就看不到呀
更何況EtBr是嵌在雙股DNA裡的 單股的DNA怎麼會用跑電泳看呢?
你可以自己測一下O.D.重新估一次
> 但我20uM loading 10ul 要者麼換算我20nt的primer量呢??
> 是不是測吸光值沒有意義 因為降解吸光值依舊沒變對吧
> 請問有更好的方法可以得知我的primer是否降解??
> 還是大家有P不出來 搞了很久才發現的原因 也請妳PO出來分享給大家 謝謝^^
一般來說 primer已經很小了 不容易被降解
P不出來原因大多是primer的設計 和本身要P的產物的特性
cDNA一般會遇到的是GC repeat太多
genomic DNA 通常是因為和histon纏繞 有鬆有緊
若不幸你要P的位置剛好接近heterochromatin 那就很難P
通常可以換抽取sample的方法 或換primer 或分段P
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夢之大地 逼逼ㄟ四 █▁◤ █ █ █▁▁ █ █ ▉▉▉ █▁ █ █ █ █ █▁◤
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作者 aggaci (五子棋啦) 看板 Biotech
標題 Re: 如何測試primer是否降解
時間 Mon Dec 13 13:42:09 2004
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※ 引述《julep.bbs@bbs.ccns.ncku.edu.tw (再混!你就倒大楣了)》之銘言：
: > 因為我是自己看paper配lysis buffer 來打破癌細胞 只是每次真的不者麼純
: > 已經抽了快10遍了 我只是抽total genomic DNA 而已
: 你要P的是genomic DNA嗎? 不是cDNA嗎?
: 如果是的話 genomic DNA本來就不好P
推~不好作!我上次amplified了一段4K的promoterP了快一個月
結果放棄
: primer很小 跑電泳本來就看不到呀
: 更何況EtBr是嵌在雙股DNA裡的 單股的DNA怎麼會用跑電泳看呢?
: 你可以自己測一下O.D.重新估一次
測OD沒啥用....沒辦法知道有沒斷 可以自己想一下測OD的原理
: cDNA一般會遇到的是GC repeat太多
: genomic DNA 通常是因為和histon纏繞 有鬆有緊
: 若不幸你要P的位置剛好接近heterochromatin 那就很難P
: 通常可以換抽取sample的方法 或換primer 或分段P
給原PO...若你真的懷疑是PRIMER degradation的問題
跟廠商反應 它會不收你錢再幫你合一次的~~
不過我覺得是 你的target本來就不好P 這個原因可能比較有可能!
promoter麻....本來就不好PCR amplified
--
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◆ From: 140.114.100.165
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作者 leisely.bbs@bbs.ym.edu.tw (嵌入器不可是類別成員), 看板 Biotech
標題 Re: 如何測試primer是否降解
時間 陽明大學神農坡資訊站 (Mon Dec 13 19:36:50 2004)
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> 給原PO...若你真的懷疑是PRIMER degradation的問題
> 跟廠商反應 它會不收你錢再幫你合一次的~~
> 不過我覺得是 你的target本來就不好P 這個原因可能比較有可能!
> promoter麻....本來就不好PCR amplified
我的經驗:
如果你的product長度超過2kb
那本來就不大好P
你可以在中間多訂一對primer(小於1kb比較好)試試看
另外PCR的溫度 和polymerase的好壞對結果的影響也很大
加油吧!!P一個月不算什麼
我曾經一整個學期都P不出來
--
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鸞 | | | | | | 》───．… ‧ ︿︿
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作者 swh.bbs@bbs.ym.edu.tw (yuppie), 看板 Biotech
標題 Re: 如何測試primer是否降解
時間 陽明大學神農坡資訊站 (Mon Dec 13 19:58:12 2004)
轉信 ptt!Group.NCTU!grouppost
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我的經驗：
從4K要amplified一段600bp左右的，最好先看看target附近
有沒有RE site 切成小片段後就容易多了，要不然可能得改
condition，我做了一個多月後來改了MgCl2及dNTPS及調
template DNA濃度後，就做出來了。
小意見僅供參考..SWH
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※ Origin: 陽明神農坡 <bbs.ym.edu.tw> ◆ From: 61.229.160.129
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作者 aggaci (五子棋啦) 看板 Biotech
標題 Re: 如何測試primer是否降解
時間 Mon Dec 13 20:41:25 2004
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: 我的經驗:
: 如果你的product長度超過2kb
: 那本來就不大好P
: 你可以在中間多訂一對primer(小於1kb比較好)試試看
: 另外PCR的溫度 和polymerase的好壞對結果的影響也很大
: 加油吧!!P一個月不算什麼
: 我曾經一整個學期都P不出來
是第 可以用接的...比較麻煩啦
不過我用接的還是共辜...Q_Q
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◆ From: 140.114.100.165
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作者 gilchang223 (也是老外) 看板 Biotech
標題 Re: 如何測試primer是否降解
時間 Mon Dec 13 22:58:34 2004
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※ 引述《coconutt (人活的快樂就好)》之銘言：
: 我的是DNA primer 約20nt
: 最近因為PCR都P不出來 所以在一項項確認
: 因為在兩個月前有P出來 但現在已經P了快一個月都沒有成果
: 所以想測試是否材料有問題
: 我的DNA的260/280偏低約1.6是否會是我P不出來的原因呢??但還是會有什麼不良影響呢?
: 因為我是自己看paper配lysis buffer 來打破癌細胞 只是每次真的不者麼純
: 已經抽了快10遍了 我只是抽total genomic DNA 而已
: 是否有人推薦哪一家的KIT好用 如果可以弄更純 有點想私下買來試試
: buffer是廠商附的 除了發霉 應該不會有問題吧
: 接著應該就是primer了 我曾經跑電泳過 沒有看到band 但我懷疑是量不夠多
: 但我20uM loading 10ul 要者麼換算我20nt的primer量呢??
: 是不是測吸光值沒有意義 因為降解吸光值依舊沒變對吧
: 請問有更好的方法可以得知我的primer是否降解??
: 還是大家有P不出來 搞了很久才發現的原因 也請妳PO出來分享給大家 謝謝^^
1.我是用Current Protocols in Molecular Biology上的方法抽genomic DNA
amplify 0.5k ~ 1k (bp)的東西還蠻好P的
另外, 如果要amplify更長的片斷, 可以試試用高級的Pfu, 聽說挺好用的.
(只是enzyme 很貴)
2.check primer方面: (麻煩的方法, sorry)
試試跑sequencing gel(urea-polyacrylamide gel)
看bromophenol blue的位置:
gel-percentage dye/(primer size)
6.0% ~26 nt.
8.0% ~19 nt.
10.0% ~12 nt.
20.0% ~8 nt.
(忘了把資料出處記下來了....)
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gilchang223 (ptt) = gilchang (wretch)
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