推 frandt:提高annealing溫度，或加DMSO(10%)218.174.207.120 03/14
→ frandt:要不就試試hot start218.174.207.120 03/14
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發信人: Bonerges.bbs@beta.life.nthu.edu.tw (被排擠了), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題] 如何決定PCR的一些參數呢
發信站: 清華生命科學 BBS (Mon Mar 14 23:34:09 2005)
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提高Tm
※ 引述《pwl.bbs@ptt.cc (蓄勢待發)》之銘言：
> 請問跑出來的PCR product有一些雜band
> 到底是要降低template DNA的濃度
> 還是要提高annealing的溫度
> 亦或降低Ma2+的濃度呢...
> 老師都叫我稀釋template
> 可是我會覺得好像應該要做後兩者.以提高特異性
> 請問到底要怎麼決定應該改變哪些數值阿...
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※ Origin: 生命科學 BBS <bbs.life.nthu.edu.tw>
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作者: Lockey (楓城之子) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 如何決定PCR的一些參數呢
時間: Tue Mar 15 00:39:23 2005
※ 引述《pwl (蓄勢待發)》之銘言：
: 請問跑出來的PCR product有一些雜band
: 到底是要降低template DNA的濃度
: 還是要提高annealing的溫度
: 亦或降低Ma2+的濃度呢...
: 老師都叫我稀釋template
: 可是我會覺得好像應該要做後兩者.以提高特異性
: 請問到底要怎麼決定應該改變哪些數值阿...
先看看您的template為何?
如果是plasmid或是一段linear DNA還有extra bands的話
代表您的primers 可能沒設計好 (mismatch部份太多, whole length不夠長,
所以Tm不夠)
如果template是genomic DNA的話, 除了上述問題外
可以把main product再從gel上extract出來當做template, 再一次PCR
同時可以採用Step down cycle program
就是先將anneling temperature用70C, 5 cycles, 再來65C 5 cycles......
一直降到最後50C做20 cycles 試看看
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