推 oplz:其實就算是 RE 接的也還是要定序一下比較保顯134.174.178.197 05/18
推 Yeee:用RE接完會定序全長嗎?之前我都只定junction而已... 24.211.190.152 05/19
最近想要把一段3.5Kb左右的片段塞進vector，
有點想用PCR直接作（其實是因為有點懶 ^^;;）
可是又覺得這個size是不是有點太大了，不是很確定其可行性...
因此想要請問版上的前輩，
不知道大家做過最大的PCR片段的大小為何呢？
對於大片段PCR有沒有什麼提高正確性的撇步？
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◆ From: 24.211.190.152
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作者: YuChHa (RESPONSIBILITY) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] PCR大小
時間: Mon May 16 22:24:45 2005
※ 引述《Yeee (小逸)》之銘言：
: 最近想要把一段3.5Kb左右的片段塞進vector，
: 有點想用PCR直接作（其實是因為有點懶 ^^;;）
: 可是又覺得這個size是不是有點太大了，不是很確定其可行性...
可以!!
: 因此想要請問版上的前輩，
: 不知道大家做過最大的PCR片段的大小為何呢？
: 對於大片段PCR有沒有什麼提高正確性的撇步？
用PFU呀
然後elongation time用4min
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最愛小嵐兒~~^_^~~
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◆ From: 59.121.143.239
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作者: jbking (我是吉米) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] PCR大小
時間: Tue May 17 08:19:12 2005
分段p啦...
燃後記得用PFU
多批幾管吧^^
※ 引述《YuChHa (RESPONSIBILITY)》之銘言：
: ※ 引述《Yeee (小逸)》之銘言：
: : 最近想要把一段3.5Kb左右的片段塞進vector，
: : 有點想用PCR直接作（其實是因為有點懶 ^^;;）
: : 可是又覺得這個size是不是有點太大了，不是很確定其可行性...
: 可以!!
: : 因此想要請問版上的前輩，
: : 不知道大家做過最大的PCR片段的大小為何呢？
: : 對於大片段PCR有沒有什麼提高正確性的撇步？
: 用PFU呀
: 然後elongation time用4min
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◆ From: 218.164.178.84
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作者: oplz (Go Heat! Win for Riley!) 站內: Biotech
標題: Re: [問題] PCR大小
時間: Tue May 17 10:05:18 2005
※ 引述《Yeee (小逸)》之銘言：
: 最近想要把一段3.5Kb左右的片段塞進vector，
: 有點想用PCR直接作（其實是因為有點懶 ^^;;）
: 可是又覺得這個size是不是有點太大了，不是很確定其可行性...
: 因此想要請問版上的前輩，
: 不知道大家做過最大的PCR片段的大小為何呢？
: 對於大片段PCR有沒有什麼提高正確性的撇步？
3.5 應該還好 我 clone 過 6 kb 的 PCR product,
不過根據我自己的經驗, PCR product 太大, 還不如用 restriction enzyme
直接 cut and paste (如果可以的話),
一來 insert DNA 量比較多,
二來 insert DNA 的品質也較有保障.除了 mutation 的問題還要考慮用 RE 處理
末端 ER site 未處理完全的損失.
3.5 kb 不算太大, PCR product cycle number 設少一點
多做幾個 rxn, 將 PCR product 一次收集多一點再做下一步.
FYI.
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◆ From: 134.174.178.197
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作者: Yeee (小逸) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] PCR大小
時間: Tue May 17 13:36:40 2005
※ 引述《oplz (Go Heat! Win for Riley!)》之銘言：
: ※ 引述《Yeee (小逸)》之銘言：
: : 不知道大家做過最大的PCR片段的大小為何呢？
: : 對於大片段PCR有沒有什麼提高正確性的撇步？
: 3.5 應該還好 我 clone 過 6 kb 的 PCR product,
: 不過根據我自己的經驗, PCR product 太大, 還不如用 restriction enzyme
: 直接 cut and paste (如果可以的話),
: 一來 insert DNA 量比較多,
: 二來 insert DNA 的品質也較有保障.除了 mutation 的問題還要考慮用 RE 處理
: 末端 ER site 未處理完全的損失.
謝謝各位。受教了。
我覺得PCR有時會讓人變得比較懶，用RE切啊接的要花不少時間設計，
有時候還要做sequential cloning，越弄越複雜。
PCR順利的話咻一下就出來了。
雖然事後要厚著臉皮拿老闆的錢把產物拿去full-length 定序。
這是題外話。
我目前的情況則是實在設計不出傳統的黏接法。
總之十分感謝 :P
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