推 YuChHa:ProTaq有TdT的活性!! 59.121.137.3 07/26
→ YuChHa:TdT = terminal deoxyribonucleotide transferase 59.121.137.3 07/26
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作者: johnyu (神氣少年) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] PCR發生的狀況
時間: Wed Jul 27 00:07:27 2005
※ 引述《fhyb (嗯..)》之銘言：
: 小弟的PCR是預計從genomic DNA中放大一段啟動子的序列
: 兩股引子的Tm值均為67度
: 反股引子上有兩處點突變
: 使用pfu polymerase 進行PCR實驗
: 電泳結果卻顯示smere的狀況
: 看不出有任何的band
: 請問這樣的狀況可能是在哪裡出了問題呢？
: 感謝熱心版友的回答~
問題可能出在primer設計,不行的話重新設計primer,不然換好一點的polymerase,
還有promoter的大小(本人經驗是選殖6kb promoter與enhancer 是用invitrogen的
pfu polymerase),一樣很專一的band,還要注意genomic DNA的品質
本人小經驗 參考吧
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◆ From: 61.228.206.188
推 coyot:請問一下 如何判斷"好一點的polymerase"呢? 61.228.142.68 07/27
推 labcorgi:價錢高一點的^^" 140.116.25.138 07/27
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作者: mandible (生化真是的難搞的東西) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] PCR發生的狀況
時間: Wed Jul 27 16:21:44 2005
※ 引述《johnyu (神氣少年)》之銘言：
: ※ 引述《fhyb (嗯..)》之銘言：
: : 小弟的PCR是預計從genomic DNA中放大一段啟動子的序列
: : 兩股引子的Tm值均為67度
: : 反股引子上有兩處點突變
: : 使用pfu polymerase 進行PCR實驗
: : 電泳結果卻顯示smere的狀況
: : 看不出有任何的band
: : 請問這樣的狀況可能是在哪裡出了問題呢？
: : 感謝熱心版友的回答~
: 問題可能出在primer設計,不行的話重新設計primer,不然換好一點的polymerase,
: 還有promoter的大小(本人經驗是選殖6kb promoter與enhancer 是用invitrogen的
: pfu polymerase),一樣很專一的band,還要注意genomic DNA的品質
: 本人小經驗 參考吧
好一點的polymerase
大部分都有proofreading的效果
我的經驗覺得...taq enzyme品質有分...聽說最高有白金級的
做出來的品質真的有差~~不過..和template的品質也有關係就是嚕~
例如白金級:有Hot taq enzyme~~
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◆ From: 203.71.87.1
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發信人: blueboy.bbs@bbs.ym.edu.tw (騎腳踏車上學), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題] PCR發生的狀況
發信站: 陽明大學神農坡資訊站 (Wed Jul 27 18:06:35 2005)
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※ 引述《fhyb.bbs@ptt.cc (嗯..)》之銘言：
> 小弟的PCR是預計從genomic DNA中放大一段啟動子的序列
> 兩股引子的Tm值均為67度
> 反股引子上有兩處點突變
> 使用pfu polymerase 進行PCR實驗
> 電泳結果卻顯示smere的狀況
> 看不出有任何的band
> 請問這樣的狀況可能是在哪裡出了問題呢？
> 感謝熱心版友的回答~
promoter的話一般來講有可能因為GC content比較高不容易打開
依小弟的淺見是再升高denaturing temperature
或者是試試不同濃度DMSO
再不行的話還是重設計引子比較快
搞不好用掉的taq都比重訂引子還要多錢了
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※ Origin: 陽明神農坡 <bbs.ym.edu.tw> ◆ From: 140.129.74.7
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作者: ndmcls (季勗) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] PCR發生的狀況
時間: Wed Jul 27 23:03:12 2005
※ 引述《fhyb (嗯..)》之銘言：
: 小弟的PCR是預計從genomic DNA中放大一段啟動子的序列
: 兩股引子的Tm值均為67度
: 反股引子上有兩處點突變
: 使用pfu polymerase 進行PCR實驗
: 電泳結果卻顯示smere的狀況
: 看不出有任何的band
: 請問這樣的狀況可能是在哪裡出了問題呢？
: 感謝熱心版友的回答~
會產生 smere 可能性有很多, 一種是 primer 設計不良, 到處黏. 另一種
比較可能發生的是, 你加的 dna 太多了.
還有, 你要的 promoter 有多長呢?
如果你要的 promoter 在 1 kb 上下, 用一般一兩千塊那種 taq 就行了,
錯誤率在 1/1000 以下, 會讓你忘了錯誤的存在, 而且還可以用 t-a vector
去 subclone.
要 p 越長的片段當然有高級 taq 可用, 一分錢一分貨, 東西做出來比較
要緊.
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作者: plantlover (^^) 站內: Biotech
標題: Re: [問題] PCR發生的狀況
時間: Fri Jul 29 12:34:52 2005
※ 引述《ndmcls (季勗)》之銘言：
: ※ 引述《fhyb (嗯..)》之銘言：
: : 小弟的PCR是預計從genomic DNA中放大一段啟動子的序列
: : 兩股引子的Tm值均為67度
: : 反股引子上有兩處點突變
: : 使用pfu polymerase 進行PCR實驗
: : 電泳結果卻顯示smere的狀況
: : 看不出有任何的band
: : 請問這樣的狀況可能是在哪裡出了問題呢？
: : 感謝熱心版友的回答~
根據我多年的經驗:P
你可以試試看降低genomic DNA的濃度(ＥＸ:把它dilute成１０分之１)
並加入ＤＭＳＯ會比較好
試試看的啦 嘿嘿嘿
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