推 Bluecold:oh ya thanks 你幫了我一個大忙!!!!! 210.85.147.138 10/31
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作者 HIbaby (嗨北鼻) 看板 Biotech
標題 Re: [問題] 有關site-directed mutagenesis
時間 Sun Oct 31 21:42:44 2004
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※ 引述《wensing (鍬形蟲)》之銘言：
: : 這樣子吧
: : 那為什麼我們在paper上面看到的電泳圖都是
: : http://www.wretch.cc/album/show.php?i=bluecold&b=1&f=1099216744.jpg&p=1
: : (上述兩個圖沒有關係)
: : 難道是因為反白比較好看?!
: : 論文中沒有提及用任何blot的方法....
: : 難道真的用blot的方法?
: : 兩個問題 謝謝
: 個人推測，應該是用放射線
我們實驗室拍照的機器可以設定反白 比方說做RT-pcr 我也習慣用反白輸出
感覺反白比較炫一點 XD
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◆ From: 219.1.156.27
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作者 ribose (保濟丸) 看板 Biotech
標題 Re: [問題] 有關site-directed mutagenesis
時間 Sun Oct 31 22:20:59 2004
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: step 4.
: 以overlapping的部份當作primer
: 進行PCR 可做出與原始template只相差一個nucleotide的DNA片段
你這樣好像做了很多次 PCR
假如你用的 polymerase 沒有好的 proofreading 的話
反而會發生更多的 mutation
我則是作 2次 PCR + 1次 overlapping
方法如下(將你的做修改 不要介意)
step 1
以紅色序列為 mutation primer + 綠色 wild-type primer
以原始的序列作為template 作出產品 A
step 2.
以一對 wild-type primer
以原始的序列作為template 作出產品 B
而產品 B 較產品 A 長 而 mutation 的位置在 產品 B 之間
___________x_____ 產品 A
_______________________產品 B
step 3.
進行overlapping
再用兩端的primer 進行放大
這樣就能獲得你要的 mutation 產物
這應該是可以做的
因為我做出來了 不過還是有二分之一的機率
會有 wild-type
運氣好就會拿到
我挑了十個colony
送了三個sequencing
中了一個
祝你好運
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◆ From: 61.229.207.248
推 abc0:Nov'04 Nature methods有完整protocol 143.48.8.154 11/03
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作者 wensing (鍬形蟲) 看板 Biotech
標題 Re: [問題] 有關site-directed mutagenesis
時間 Sun Oct 31 23:17:03 2004
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ribose兄說的對，這種狀況我有發生過。
但是要看你的片段大小，超過1kb(最終產物)或是模版GC特多
使用proofreading的polymerase比較保險一點
如果是做隨機突變，就沒差，會有意外收獲。
如果發生批出原片段(wild-type)的話，代表所使用的原template太多
(這種狀況我也有發生過)
那就要把template降低到 pmole (50~100pmole)，就不會有原片段！
但是相對地，你的產物會非常地少！
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◆ From: 211.74.219.23
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作者 Bluecold (將來,是什麼?) 看板 Biotech
標題 Re: [問題] 有關site-directed mutagenesis
時間 Sun Oct 31 23:45:04 2004
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非常感謝兩位版友的解答
的確幫我了非常大的忙
嗯 其實我問的問題是由seminar所看到的
並不是我自己做的實驗
因為對site-directed mutagenesis非常的不清楚
所以除了找資料以外
也想辦法去瞭解怎麼做!!!
這個流程中唯一讓我感覺矛盾的就是step 4.
(http://www.wretch.cc/album/show.php?i=bluecold&b=1&f=1099214494.jpg&p=0 如圖)
而這仰賴wensing兄的解答
可利用splicing by overlap extending來完成
而Ribose兄所提出的另外一個方法
也的確可行
只是在本實驗中作者並沒有提及相關的實驗
因此只能敘述site-directed mutagenesis的一般標準流程
不能對實驗的方法多做猜測
但是這個方法或許可作為替代方案也說不定
這裡我有想到另外一個方法想聽聽大家的意見
也就是說直接利用附圖中
http://www.wretch.cc/album/show.php?i=bluecold&b=1&f=1099214494.jpg&p=0
擁有紅綠兩種primer的DNA片段本身當作primer
與最原始的template(390-bp)做PCR
這樣子一來
上面那一條約300-bp 下面那一條約90-bp
對primer來說 會不會有困難
因為一般來說primer的長度應該是沒有太大限制的才對
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◆ From: 210.85.147.138
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作者 wensing (鍬形蟲) 看板 Biotech
標題 Re: [問題] 有關site-directed mutagenesis
時間 Mon Nov 1 00:45:43 2004
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※ 引述《wensing (鍬形蟲)》之銘言：
: 這種突變方法稱 SOEing (Splicing by Overlap Extension)
: : 以overlapping的部份當作primer
: : 進行PCR 可做出與原始template只相差一個nucleotide的DNA片段
: : 我找到一個網站
: : http://www.buckinstitute.org/benz/prot/prot12.htm
: : 講述site-directed mutagenesis protocol
: : 我看不出來與我這個方法相異的地方
: 兩者一樣
對不起，我看懂了原作者的敘述，兩者都不太一樣
除了ribose兄所說的會做多次pcr之外
從step1至step2 你必須先純化你的產品一(單股DNA)
然後再跟綠色wild-type primer進行PCR，然後再純化，再進行overlapping
純化的過程，可能會有問題產生。
多了一步驟，就是麻煩。
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◆ From: 211.74.219.23
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作者 wensing (鍬形蟲) 看板 Biotech
標題 Re: [問題] 有關site-directed mutagenesis
時間 Mon Nov 1 00:59:16 2004
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: 這裡我有想到另外一個方法想聽聽大家的意見
: 也就是說直接利用附圖中
: http://www.wretch.cc/album/show.php?i=bluecold&b=1&f=1099214494.jpg&p=0
: 擁有紅綠兩種primer的DNA片段本身當作primer
: 與最原始的template(390-bp)做PCR
: 這樣子一來
: 上面那一條約300-bp 下面那一條約90-bp
: 對primer來說 會不會有困難
: 因為一般來說primer的長度應該是沒有太大限制的才對
這樣子會有問題
(1)兩片段差太大，你的elongation時間要以那一片段為主390bp還是90bp
300 ------------X------- 300 -----------------X--------------------
90 -----X------- 90 -----------------X---
(2)要考慮primer的亂黏與髮夾(特別是300bp)形成，提高黏合溫度可能無法解決
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