18s rDNA 作internal control要者麼作

作者coconutt (人活的快樂就好)

看板Biotech

標題18s rDNA 作internal control要者麼作

時間Fri Nov 26 00:33:09 2004

只看過用18s rRNA作過要者麼用18s rDNA作internal control 因為作southern 所以要用DNA 我的構想是將我取的total genomic DNA 去找出裡頭的18s DNA作出primer 在作PCR 來合成18s rDNA 在label 成probe 但是我可以像作northern一樣在含EtBr的agrose上看到 18s rDNA 的band嗎還是我可以在transfer membrane 上同時hybridization 兩個probe 一個是我的target DNA probe 一個是18s rDNA probe但感覺好像有點怪怪的畢竟northern不是這樣做爾且專一性應該也會有問題?? 但我查到paper都是在講18s rRNA作control 真的不會啦誰教教我>< -- 變變變時代正在改變扁扁扁選叫愛要選阿扁夢想就要實現陽光已經看見 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.213.145

推 blence:你可否談談為什麼要用18s rDNA呢？ 61.31.145.245 11/26

推 coconutt:做的是southern而且你一次作要internal 140.112.137.209 11/26

→ coconutt:control的實驗所以就先模仿一篇跟我做ꔠ 140.112.137.209 11/26

→ coconutt:主題一樣的PAPER 140.112.137.209 11/26

→ coconutt:主題相同的PAPER 140.112.137.209 11/26

推 key:對不過probe自己作用普通primers即可 219.84.20.245 11/28

> --------------------------------------------------------------------------- < 作者 gilchang.bbs@bbs.wretch.cc (也是老外), 看板 Biotech 標題 Re: 18s rDNA 作internal control要者麼作時間無名小站 (Sun Nov 28 00:43:52 2004) 轉信 ptt!Group.NCTU!grouppost ─────────────────────────────────────── ※ 引述《coconutt.bbs@ptt.cc (人活的快樂就好)》之銘言： > ※ 引述《gilchang.bbs@bbs.wretch.cc (也是老外)》之銘言： > : 是可以用不同的東西去做雜合，你沒必要從genomic DNA當中量產再製成probe， > : 一樣可以訂18S specific primer做成probe再去hybridize。 > : (不過你要先看看18S probe會不會有non-specific binding的情形) > 請問你意思是我先把18S rDNA的sequence 找出來設計primer > 並請廠商在primer上面label螢光(例如像dig 因為之後我要用這system) > 之後作PCR 就可以得到18s rDNA的probe 嗎我沒做過用dig labeled的所以看看有沒有版友知道該怎麼弄吧不好意思 -- 夫兵者不祥之器物或惡之故有道者不處君子居則貴左用兵則貴右兵者不祥之器非君子之器不得已BLOG http://www.wretch.cc/blog 安西教練我想寫日記嗚嗚o志於天下矣吉事尚左凶事尚右偏將軍居左上將軍居右言以喪禮處之殺人之眾以哀悲泣之戰勝以喪禮處之道常無名樸雖小天下莫能臣侯王若能守之萬物將自賓天地相合以降甘露民莫之令而自均始制有名名亦既有夫亦將知止知止 218-167-2-200.dynamic.hinet.net海 > --------------------------------------------------------------------------- < 作者 csmceddie (eddie) 看板 Biotech 標題 Re: 18s rDNA 作internal control要者麼作時間 Sun Nov 28 03:51:45 2004 ─────────────────────────────────────── ※ 引述《coconutt (人活的快樂就好)》之銘言： : 只看過用18s rRNA作過要者麼用18s rDNA作internal control : 因為作southern 所以要用DNA : 我的構想是將我取的total genomic DNA 去找出裡頭的18s DNA作出primer : 在作PCR 來合成18s rDNA 在label 成probe : 但是我可以像作northern一樣在含EtBr的agrose上看到 18s rDNA 的band嗎 : 還是我可以在transfer membrane 上同時hybridization 兩個probe : 一個是我的target DNA probe 一個是18s rDNA probe但感覺好像有點怪怪的 : 畢竟northern不是這樣做爾且專一性應該也會有問題?? : 但我查到paper都是在講18s rRNA作control 真的不會啦誰教教我>< 說真的...我有點看不懂你要問的問題再哪裡... 不過我大概猜了ㄧ下我想你這裡指18s rRNA當internal control應該是直接用EtBr去染膠所看到的18s rRNA的band吧所以你想問在Southern裡是不是也可以用這種方式當internal control是嗎?? 答案是不行因為在做Northern時 total RNA裡18s rRNA的量是比一般的mRNA多很多所以可以直接染EtBr就可以看到18s rRNA的band 但是在做Southern時 total DNA裡18s rRNA的基因跟其他基因得copy number是差不了多少的所以染EtBr在gel上妳看到的會是ㄧ條smear的DNA 無法直接看到18s rRNA的基因在哪因此要去合成18s rRNA的probe 然後才能在membrane上hybrid才能看到18s rRNA基因的所在所以不是像你說的合成probe然後加到genome DNA裡再跑膠另外也不會有你所謂的同ㄧ張membrane 可以hybrid兩個probe(18s rRNA與18s rRNA的基因) 因為Northern的membrane上只會有18s rRNA 而在Southern的membrane上只會有18s rRNA的基因所以這是兩個分開的實驗不知道這樣有沒有回答到你的問題?? 我會建議你先去搞清楚這兩個實驗的原理然後再來做另外DIG的system我還蠻熟的不過等你真的搞清楚這兩個實驗的原理後如果真的還有DIG labeling方面的問題到時再幫你解答吧.... -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 61.229.122.48 > --------------------------------------------------------------------------- < 作者 coconutt (人活的快樂就好) 看板 Biotech 標題 Re: 18s rDNA 作internal control要者麼作時間 Sun Nov 28 09:51:30 2004 ─────────────────────────────────────── : 如果真的還有DIG labeling方面的問題 : 到時再幫你解答吧.... 所以我是在作southern 因為我查的文獻或以前作過的實驗是用18s rRNA作northern的internal control 但這次實驗的southern是用18s rDNA作internal control 所以不知如何下手手上的paper 是一篇為發表的paper 所以沒有詳盡的材料方法和實驗結果圖片所以老闆要我做做看會有什麼結果而我的想法是將tatoal DNA 設計18s rDNA primer 作PCR 再label dig 作成probe 之後將total DNA 電泳照理講我會在EtBr下看到我要的mitDNA 但是我看的到18s rDNA的band嗎??? 我覺得應該看不到阿所以不知道該者麼作倘若看的到我再把那片膠切開個別hybridization 個別的probe 所以想請問是否有人這麼做過 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.213.145 > --------------------------------------------------------------------------- < 作者 csmceddie (eddie) 看板 Biotech 標題 Re: 18s rDNA 作internal control要者麼作時間 Sun Nov 28 12:06:15 2004 ─────────────────────────────────────── ※ 引述《coconutt (人活的快樂就好)》之銘言： : 其實我是在作mitDNA的deletion的程度因此要用18s rDNA作internal control : 所以我是在作southern : 因為我查的文獻或以前作過的實驗是用18s rRNA作northern的internal control : 但這次實驗的southern是用18s rDNA作internal control 所以不知如何下手 : 手上的paper 是一篇為發表的paper 所以沒有詳盡的材料方法和實驗結果圖片 : 所以老闆要我做做看會有什麼結果 : 而我的想法是將tatoal DNA 設計18s rDNA primer 作PCR 再label dig : 作成probe 之後將total DNA 電泳照理講我會在EtBr下看到我要的mitDNA : 但是我看的到18s rDNA的band嗎??? 我覺得應該看不到阿所以不知道該者麼作 : 倘若看的到我再把那片膠切開個別hybridization 個別的probe : 所以想請問是否有人作過者麼作既然你是run total DNA 就不可能可以直接染EtBr 然後就看到你要的基因片段ㄧ定要用probe在membrane上hybrid才看的到我想這應該很簡單吧像你說的阿就設計兩對primer ㄧ個是夾出妳要看的mit DNA的基因另ㄧ個就設計夾出18s rDNA的然後用PCR合成probe (PCR完後上面自己會label上DIG) 接著就去hybrid你的membrane阿當然如果你確定這兩個片段的size不會重疊的話妳就可以同時hybrid兩個probe 如果不確定的話那就先hybrid完第一個probe後然後再把他洗掉接著再hybrid第二個probe就好啦 (不過你要先確定你買的DIG是可以wash的他分有2種可以wash跟不能wash的) -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 61.229.122.48 > ---------------------------------------------------------------------------- < 作者 coconutt (人活的快樂就好) 看板 Biotech 標題 Re: 18s rDNA 作internal control要者麼作時間 Sun Nov 28 13:11:42 2004 ─────────────────────────────────────── ※ 引述《csmceddie (eddie)》之銘言： : : 但是我看的到18s rDNA的band嗎??? 我覺得應該看不到阿所以不知道該者麼作 : : 倘若看的到我再把那片膠切開個別hybridization 個別的probe : : 所以想請問是否有人作過者麼作 : 既然你是run total DNA : 就不可能可以直接染EtBr 然後就看到你要的基因片段有loading marker上去應該可以看到我要的片段吧 16.5mtDNA跟 18s rDNA應該都可以吧? 還是這樣會有問題呢?? : 當然如果你確定這兩個片段的size不會重疊的話 : 妳就可以同時hybrid兩個probe 這樣會不會有干擾現象呢??因為還沒看過有人一次放兩個probe 所以有點疑問 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.213.145 > --------------------------------------------------------------------------- < 作者 csmceddie (eddie) 看板 Biotech 標題 Re: 18s rDNA 作internal control要者麼作時間 Sun Nov 28 16:29:19 2004 ─────────────────────────────────────── ※ 引述《coconutt (人活的快樂就好)》之銘言： : ※ 引述《csmceddie (eddie)》之銘言： : : 既然你是run total DNA : : 就不可能可以直接染EtBr 然後就看到你要的基因片段 : 有loading marker上去應該可以看到我要的片段吧 16.5mtDNA跟 18s rDNA應該都可以吧 : 還是這樣會有問題呢?? 妳拿total genome DNA直接去切酵素然後跑ㄧ片小片的gel染EtBr看看這樣你應該就明白我再說什麼了.... : : 當然如果你確定這兩個片段的size不會重疊的話 : : 妳就可以同時hybrid兩個probe : 這樣會不會有干擾現象呢??因為還沒看過有人一次放兩個probe 所以有點疑問干擾當然是有可能阿就如我說的如果你這兩個基因切完酵素後的片段size差不多那你就不能這樣做阿或是兩個probe的序列會互黏也不行阿所以我才說你要先確定是否可以這是比較偷懶的方法啦可以省時間 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 61.229.122.48