推 KaurJmeb:去拜拜 11/26 21:06
推 polyhedron:臺灣不流行“人品問題”的解釋麼﹖多捐助窮苦民眾吧... 11/26 21:06
推 polyhedron:呵呵﹐兩岸思維的共同點和差異。。有神和無神論的迷信 11/26 21:12
推 yun19:taq有沒有試新的(or換一個批號) 11/26 21:56
→ yun19:或PCR machine校正一下溫度 11/26 21:57
推 oxoox:除了拜拜以外 yun19講的我都做過了 11/27 01:51
推 deathscytheX:有沒有可能是你的template DNA degrade掉了?? 11/27 13:05
推 polyhedron:你說這些料平時都放在4度冰箱﹐我一般都放-20度啊 11/27 17:02
推 hsiaohy:檢查一下PCR機器，其實還蠻容易壞掉的 11/27 18:01
→ hsiaohy:PCR machine用久了常會有幾個well溫度不準 11/27 18:02
→ hsiaohy:叫廠商過來測試一下每個well的溫度，你先跟隔壁實驗室 11/27 18:02
→ hsiaohy:借他們的PCR機器試試看 11/27 18:03
推 oxoox:那台機器 我同事做別的沒有問題 然後dna拿去做別的primer ok 11/27 22:07
→ oxoox:我的藥做別組primer沒有問題 所以..... 11/27 22:08
→ oxoox:還有 我們家的藥從以前到現在都是放在4度.用這個去跟老闆講 11/27 22:09
→ oxoox:會被殺頭........ 11/27 22:09
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e作者: oxoox (仵作) 看板: Biotech
標題: Re: 突然 pcr就做不出來了...請指點迷津 謝謝
時間: Mon Nov 28 00:03:35 2005
關於大家說的機器溫度的問題
(我們隔壁沒有別的實驗室了)
我有設計另一個reverse跟原來的 forward配對
剛好也是跟原本的溫度一樣
所以我放在一起做
放的時候 會隨意放
不會第一排是 原來的primer 第二排是新的primer
是非常隨意的放
結果 新的primer做的非常好 沒有問題
可是原來的primer做出來就是糊糊的
他們都用一樣的solution 除了 reverse不一樣
這樣應該可以排除機器的問題了吧
謝謝大家幫我想
大家再多努力
拜託拜託 不然我會被老闆盯死
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 203.73.197.78
※ 編輯: oxoox 來自: 203.73.197.78 (11/28 00:04)
推 Liat:primer壞掉了啊 11/28 00:12
推 polyhedron:那就重新設計引物吧﹐可能挪兩個鹼基就好 11/28 05:31
推 oxoox:那個大家 可以focus在之前做的出來 現在做不出來的原因嗎 11/28 12:08
推 Liat:東西之前沒壞 現在才壞 11/28 18:55
推 oxoox:我有訂過新的primer這樣可以解釋這點嗎 11/28 20:22
→ oxoox:當然 做到現在 幾乎所有的藥都換過了 也做不出來以前的樣子 11/28 20:23
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作者: ctlee (寧靜小城) 看板: Biotech
標題: Re: 突然 pcr就做不出來了...請指點迷津 謝謝
時間: Mon Nov 28 11:23:40 2005
※ 引述《oxoox (仵作)》之銘言：
: 我最近在做一個pcr
: 本來都P的好好的
: 雖然band下面多少有一點primer dimer
: 但是至少主band 比primer亮的多
: 可是有一天
: 突然就做不出來 底下的primer dimer超亮的
: 然後 就再也做不出來....
: 這兩批PCR 我沒有換solution 也沒有換機器
: 我在做pcr之前都會把溶液好好混勻再離心
: Taq buffer, Mg2+, dNTP, primer平常是存放在 4度的冰箱
^^^^^^^^^^^^^^^^
這不太對吧! dNTP和primer小心壞掉
建議你把dNTP, buffer, Mg2+換新
: 然後 我拿新的solution 再做一次 也做不出來
: 重新從-20 度的冰箱稀釋primer
: 甚至我也把primer重新order
: 重新try condition也做過
: 也做不出來
: 當然 我也換過別人做
: 有時候會有band 出現 但是底下的primer dimer比上面的band 亮
: 而我的主band 也糊糊的看不太清楚
: 有人可以解釋是怎麼了嗎...
: 救救我吧 老闆一直叫我要把原因找出來
: 我只能解釋如何改進primer dimer
: 但是我無法解釋為何之前做的出來 後來又不行
: 拜託大家了...
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 128.138.41.72
→ oxoox:這個我已經換過好幾瓶了唷 而且去做別的沒有問題唷y 11/28 12:09
推 havenn:enzyme? 11/29 00:00
推 kcor:原ｐｏ已經換過ｅｎｚｙｍｅ了 拜託爬個文 11/29 17:20
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發信人: calamary.bbs@bbs.ccns.ncku.edu.tw (...), 看板: Biotech
標 題: Re: 突然 pcr就做不出來了...請指點迷津 謝謝
發信站: 夢之大地 (Thu Dec 1 00:51:15 2005)
轉信站: ptt!Group.NCTU!grouppost!Group.NCTU!Dream
※ 引述《oxoox.bbs@ptt.cc (仵作)》之銘言：
> 我最近在做一個pcr
> 本來都P的好好的
> 雖然band下面多少有一點primer dimer
> 但是至少主band 比primer亮的多
> 可是有一天
> 突然就做不出來 底下的primer dimer超亮的
> 然後 就再也做不出來....
> 這兩批PCR 我沒有換solution 也沒有換機器
> 我在做pcr之前都會把溶液好好混勻再離心
> Taq buffer, Mg2+, dNTP, primer平常是存放在 4度的冰箱
> 然後 我拿新的solution 再做一次 也做不出來
> 重新從-20 度的冰箱稀釋primer
> 甚至我也把primer重新order
> 重新try condition也做過
> 也做不出來
> 當然 我也換過別人做
> 有時候會有band 出現 但是底下的primer dimer比上面的band 亮
> 而我的主band 也糊糊的看不太清楚
> 有人可以解釋是怎麼了嗎...
> 救救我吧 老闆一直叫我要把原因找出來
> 我只能解釋如何改進primer dimer
> 但是我無法解釋為何之前做的出來 後來又不行
> 拜託大家了...
您有primer dimer而且還滿亮的 那應該代表enzyme仍有作用
只是primer沒辦法bind到特定的seq
我直覺會建議您減少primer的濃度 並增長hot srart的時間
假如還不行的話
那就重新調整annealing的溫度吧 說不定是機器的溫度不準確了.....
我覺得是這樣..
--
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夢之大地 逼逼ㄟ四 █▁◤ █ █ █▁▁ █ █ ▉▉▉ █▁ █ █ █ █ █▁◤
※ Origin: <bbs.ccns.ncku.edu.tw> ◆ From: 211-74-82-184.adsl.dynamic.seed.ne
推 oxoox:我有減少過pprimer的濃度 但是沒有用 12/01 09:47
→ oxoox:請問怎樣才可以延長hot start的時間呢 12/01 09:48
> -------------------------------------------------------------------------- <
作者: oxoox (仵作) 看板: Biotech
標題: Re: 突然 pcr就做不出來了...請指點迷津 謝謝
時間: Thu Dec 1 21:00:43 2005
感謝這位網友給我的建議
讓我想到
我可以把pcr的作用時間延長看看
所以我把本來 95c 5' 95c 60" 64c 60" 72c 60" 72c 5'
改成
95c 8'30" 95c 90" 64c 90" 72c 90" 72c 5'
果然做出來的可以像我之前沒出問題那樣
雖然dimer還是有點多 但是主band會比較明顯比dimer亮
我想了很久
這樣跟我突然做不出來的原因有關嗎
還是這只是一個可以改進實驗的條件
而我真正做不出來的原因另有其他......
請大家再多給我一些想法好嗎 謝謝大家 ^^*
※ 引述《calamary.bbs@bbs.ccns.ncku.edu.tw (...)》之銘言：
: 您有primer dimer而且還滿亮的 那應該代表enzyme仍有作用
: 只是primer沒辦法bind到特定的seq
: 我直覺會建議您減少primer的濃度 並增長hot srart的時間
: 假如還不行的話
: 那就重新調整annealing的溫度吧 說不定是機器的溫度不準確了.....
: 我覺得是這樣..
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 203.73.12.10
推 lakerjackt:請問你是p多長阿? 12/01 22:22
推 oxoox:160-220bp 12/02 18:46
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作者: dorphilvet ( ) 看板: Biotech
標題: Re: 突然 pcr就做不出來了...請指點迷津 謝謝
時間: Thu Dec 8 22:24:14 2005
你才200多bp，你作用的時間實在太久了
taq一分鐘可以做約1000個bp
也許時間不是問題
你可以減少primer的量
或提高anneling的溫度
不然就提高鎂的濃度
你試試看吧
※ 引述《oxoox (仵作)》之銘言：
: 感謝這位網友給我的建議
: 讓我想到
: 我可以把pcr的作用時間延長看看
: 所以我把本來 95c 5' 95c 60" 64c 60" 72c 60" 72c 5'
: 改成
: 95c 8'30" 95c 90" 64c 90" 72c 90" 72c 5'
: 果然做出來的可以像我之前沒出問題那樣
: 雖然dimer還是有點多 但是主band會比較明顯比dimer亮
: 我想了很久
: 這樣跟我突然做不出來的原因有關嗎
: 還是這只是一個可以改進實驗的條件
: 而我真正做不出來的原因另有其他......
: 請大家再多給我一些想法好嗎 謝謝大家 ^^*
: ※ 引述《calamary.bbs@bbs.ccns.ncku.edu.tw (...)》之銘言：
: : 您有primer dimer而且還滿亮的 那應該代表enzyme仍有作用
: : 只是primer沒辦法bind到特定的seq
: : 我直覺會建議您減少primer的濃度 並增長hot srart的時間
: : 假如還不行的話
: : 那就重新調整annealing的溫度吧 說不定是機器的溫度不準確了.....
: : 我覺得是這樣..
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.120.117.61
推 oxoox:你說的這些我都做過囉 只有加長時間才做的出來 12/09 13:25