推 ssuny:你p出來的product是blunt-end還是sticky-end啊? 01/10 01:08
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作者: tonyroro (孤獨存在) 看板: Biotech
標題: Re: 想請問ＰＣＲ的問題
時間: Tue Jan 10 00:33:28 2006
※ 引述《hicage (hicage)》之銘言：
: 不知道大家有沒有遇過這種問題：
: 雖然我知道不同廠牌的Tag，效果會不同
: 但是如果使用便宜的品牌，可以ｐ出product
: 反而使用qiagen無法ｐ出任何東西
: 這樣所ｐ出來的product可信嗎？
: （condition條件皆相同）
: 此外我還試過用此product稀釋後當template
: 然後用qiagen來ｐ還是不行
: 因為我將此product拿去做cloning，
: 出來的結果都是self ligation, （嘗試過多種insert:vector比例,歷經半年＞＿＜）
: 實在很好奇是不是此product根本不是正確的東西?還是cloning技術的問題?
是不是你qiagen那管酵素是壞的阿 你有試過去P 一些internal control嗎?
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◆ From: 203.203.18.64
推 hicage:有阿~~~之間還有買過一次新的qiagen 結果也是p不出來 01/10 19:00
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作者: u8524009 (再也不要為愛傷心了!) 看板: Biotech
標題: Re: 想請問ＰＣＲ的問題
時間: Tue Jan 10 01:15:21 2006
※ 引述《hicage (hicage)》之銘言：
: 不知道大家有沒有遇過這種問題：
: 雖然我知道不同廠牌的Tag，效果會不同
: 但是如果使用便宜的品牌，可以ｐ出product
: 反而使用qiagen無法ｐ出任何東西
: 這樣所ｐ出來的product可信嗎？
: （condition條件皆相同）
: 此外我還試過用此product稀釋後當template
: 然後用qiagen來ｐ還是不行
: 因為我將此product拿去做cloning，
: 出來的結果都是self ligation, （嘗試過多種insert:vector比例,歷經半年＞＿＜）
: 實在很好奇是不是此product根本不是正確的東西?還是cloning技術的問題?
cloning出來的結果都是self ligation並不能證明你PCR出來後的產物是錯的..
因為會產生self ligation的情形不在少數...
想知道你用便宜廠牌PCR出來的product是不是錯的..最起碼你可以check一下你
產物大小是不是和你預計的大小一樣,如果一樣,應該就不是PCR的問題...
至於你說用qiangen的Tag沒辦法p出product,這有很多原因,畢竟每一家的enzyme不同,
建議你可以改一下extension的時間試試..亦或是改變一下annealing的溫度試試.
用PCR的product做為insert進行cloning,如果需要經由restriction enzyme
digesting的步驟,通常要成功cloning的機率爆低的,最大的原因是pcr的product
在進行restriction enzyme的效果很差,即使你在cutting site後面有多設計3個mer
切的效果還是很差的(不要相信catalog上面寫的,那些寫說在terminl cutting
效果就算是70%,真的下去切還是很差,本人有切身之痛).
cloning最好的方法還是利用TA cloning的方式,成功率幾乎是百分百.不會有看到
一堆clony的形成,結果挑出來都是一堆self ligation的情形發生.
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◆ From: 140.114.96.172
推 ROKEE:我都拿pUC切blunt end再接Pfu夾出來的東西，最後藍白篩 01/10 01:54
推 haleywen:可以直接拿PCR產物定序看看是不是對的 01/10 01:58
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作者: ROKEE (可不可以不要再胖下去啦~) 看板: Biotech
標題: Re: 想請問ＰＣＲ的問題
時間: Tue Jan 10 02:01:10 2006
※ 引述《u8524009 (再也不要為愛傷心了!)》之銘言：
: cloning出來的結果都是self ligation並不能證明你PCR出來後的產物是錯的..
: 因為會產生self ligation的情形不在少數...
: 想知道你用便宜廠牌PCR出來的product是不是錯的..最起碼你可以check一下你
: 產物大小是不是和你預計的大小一樣,如果一樣,應該就不是PCR的問題...
: 至於你說用qiangen的Tag沒辦法p出product,這有很多原因,畢竟每一家的enzyme不同,
: 建議你可以改一下extension的時間試試..亦或是改變一下annealing的溫度試試.
拉個gradient就知道啦~
: 用PCR的product做為insert進行cloning,如果需要經由restriction enzyme
: digesting的步驟,通常要成功cloning的機率爆低的,最大的原因是pcr的product
: 在進行restriction enzyme的效果很差,即使你在cutting site後面有多設計3個mer
: 切的效果還是很差的(不要相信catalog上面寫的,那些寫說在terminl cutting
: 效果就算是70%,真的下去切還是很差,本人有切身之痛).
反正一般挑clone有一顆對就夠了
: cloning最好的方法還是利用TA cloning的方式,成功率幾乎是百分百.不會有看到
^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^
are you sure???
一般Taq就算有proof-readin能力效果也沒多好
最後還是定序最大啦~~
: 一堆clony的形成,結果挑出來都是一堆self ligation的情形發生.
接PCR product然後挑clone這是再基本不過的東西吧?!
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◆ From: 218.162.81.217
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作者: u8524009 (再也不要為愛傷心了!) 看板: Biotech
標題: Re: 想請問ＰＣＲ的問題
時間: Tue Jan 10 02:15:31 2006
: 反正一般挑clone有一顆對就夠了
^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^
別笑我,我就是屬於那種挑很久都挑不到的人...我第一次做的cloning足足挑了
半年才做出來...
: : cloning最好的方法還是利用TA cloning的方式,成功率幾乎是百分百.不會有看到
: ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^
: are you sure???我是說不要總是挑到self ligation的機率嘛,不然每次挑到的
都是vector only的結果,會做到沒力呀,序列對不對本來就要定序才知道呀!!
: 接PCR product然後挑clone這是再基本不過的東西吧?!
^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^
沒錯呀,TA cloning的A就是PCR出來的產物呀,不過要記得用只會在PCR product
尾端加一個A的Tag唷 !!
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◆ From: 140.114.96.172
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作者: hicage (hicage) 站內: Biotech
標題: Re: 想請問ＰＣＲ的問題
時間: Tue Jan 10 19:31:22 2006
先謝謝大家的回文:)
我先回答大家問的一些問題順便做更詳細的補述,
1.product送定序:
唉~~~其實那時是因為實驗室經費有限,所以沒有送(os:我也很想送定序>_<)
通常我們會送定序的是已經cloning完成的重組質體,或是其他更重要的product...
不過我已經發現我try的次數成本可以定序好幾次了
2.p出來產物大小2.5kb:
的確是與我predict size相同,
但是最神奇的是因為p出來product的濃度不高,之後又要做purify,digest,再purify,
因此將product稀釋1:100當template
用便宜的tag和qiagen tag去p, 想要增量
-condition(便宜tag):同第一次pcr
-condition(qiagen):try 同第一次pcr和Tm減5度
最後都沒有p出任何東西(晴天霹靂)
我實在想不透為何這樣會p不出來??
也是因為這樣我才會質疑product的正確性
此外也是因為我們實驗室做任何cloning皆不是用TA cloning,
所以當初設計primer也就沒有考慮,
我很能體會有板友說做miniprep抽出來的都是vector only的感覺
miniprep一批做48個,同時做pcr screening
plate上長的colony都被我挑完了
結果發現沒有一個insert,心酸阿~~~
※ 引述《u8524009 (再也不要為愛傷心了!)》之銘言：
: : 反正一般挑clone有一顆對就夠了
: ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^
: 別笑我,我就是屬於那種挑很久都挑不到的人...我第一次做的cloning足足挑了
: 半年才做出來...
: : ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^
: : are you sure???我是說不要總是挑到self ligation的機率嘛,不然每次挑到的
: 都是vector only的結果,會做到沒力呀,序列對不對本來就要定序才知道呀!!
: : 接PCR product然後挑clone這是再基本不過的東西吧?!
: ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^
: 沒錯呀,TA cloning的A就是PCR出來的產物呀,不過要記得用只會在PCR product
: 尾端加一個A的Tag唷 !!
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◆ From: 140.112.76.95
推 blence:vector only代表RE沒切乾淨,與PCR產物多寡無關,不是嗎？ 01/10 19:55
推 hicage:我怕是因為insert濃度太低導致clone不成功,才會去p兩次 01/10 20:04
推 haleywen:Vector 加做CIP 01/11 00:07
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EE作者: soom (躲貓貓..) 看板: Biotech
標題: Re: 想請問ＰＣＲ的問題
時間: Wed Jan 11 01:53:35 2006
: 2.5kb的TA，用一般方法就算成功也會不少mutant
: 乖乖用pfu比較保險
關於TA 其實也可以先用Pfu做出blunt end之後
再用一般的Taq尾端加A (72 度 20分鐘)
我自己用promega pGEM-Teasy的經驗是
(可參照 pGEM-Teasy那一本manual)
25 ng purified Pfu product (1.5 Kb)
↓
"A-tailing" in 20 ul Taq reaction
↓
3 ul A-tailing product + 50 ng pGEM-Teasy vector + etc..
= 10 ul total ligation reaction
↓
4度C ligation overnight
還是挑的到我要的clone
不過我的insert長度只有1.5 Kb
換算成molar ratio 只有 1 : 0.125 (vector : insert，我知道是個誇張的比例)
用這樣的方法我目前為止挑clone的成功率有66% (2次 / 3個)
也許是我運氣好吧?! 不過還是給板友做參考
此外，如果想用一次PCR完成且具有high fidelity，就需要花錢了
像是Invitrogen的 Easy-A這些產品就可以做到
翻翻各家的catalog都不難找。
(我們老闆說這種enzyme就是用Pfu混一定比例的Taq
可以試看看自己混，不過這又是另一段慘痛的的經驗了
我自己的感覺是如果reaction buffer的成分不太一樣的話，還是不要硬做的好)
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◆ From: 202.178.170.211
※ 編輯: soom 來自: 202.178.170.211 (01/11 01:55)
推 blence:你很多地方不小心筆誤把ng寫成ug了 01/11 02:20
感謝blence板友指正，
此外，我的molar ratio也算錯了..更正為 1:0.125
※ 編輯: soom 來自: 202.178.170.211 (01/11 02:29)
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作者: soom (躲貓貓..) 看板: Biotech
標題: Re: 想請問ＰＣＲ的問題
時間: Wed Jan 11 02:33:16 2006
25 ng purified Pfu product (1.5 Kb)
↓
"A-tailing" in 20 ul Taq reaction
↓
3 ul A-tailing product + 50 ng pGEM-Teasy vector + etc..
= 10 ul total ligation reaction
↓
4度C ligation overnight
感謝blence板友指正，我的單位寫錯了，是ng
此外，我的molar ratio也算錯了..更正為 1:0.125
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◆ From: 202.178.170.211
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作者: micocat (de novo) 看板: Biotech
標題: Re: 想請問ＰＣＲ的問題
時間: Wed Jan 11 19:45:26 2006
即使是p到相同size的product也有可能不是你要的東西
建議你可以將pcr product先用retriction enzyme做digestion check
確認pcr的結果是你要的，再去探討其他可能的原因吧~ ^^
※ 引述《hicage (hicage)》之銘言：
: 先謝謝大家的回文:)
: 我先回答大家問的一些問題順便做更詳細的補述,
: 1.product送定序:
: 唉~~~其實那時是因為實驗室經費有限,所以沒有送(os:我也很想送定序>_<)
: 通常我們會送定序的是已經cloning完成的重組質體,或是其他更重要的product...
: 不過我已經發現我try的次數成本可以定序好幾次了
: 2.p出來產物大小2.5kb:
: 的確是與我predict size相同,
: 但是最神奇的是因為p出來product的濃度不高,之後又要做purify,digest,再purify,
: 因此將product稀釋1:100當template
: 用便宜的tag和qiagen tag去p, 想要增量
: -condition(便宜tag):同第一次pcr
: -condition(qiagen):try 同第一次pcr和Tm減5度
: 最後都沒有p出任何東西(晴天霹靂)
: 我實在想不透為何這樣會p不出來??
: 也是因為這樣我才會質疑product的正確性
: 此外也是因為我們實驗室做任何cloning皆不是用TA cloning,
: 所以當初設計primer也就沒有考慮,
: 我很能體會有板友說做miniprep抽出來的都是vector only的感覺
: miniprep一批做48個,同時做pcr screening
: plate上長的colony都被我挑完了
: 結果發現沒有一個insert,心酸阿~~~
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◆ From: 140.114.96.88
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作者: Stephenmy (幻殞黯翼) 看板: Biotech
標題: Re: 想請問ＰＣＲ的問題
時間: Wed Jan 11 20:53:11 2006
※ 引述《hicage (hicage)》之銘言：
: 不知道大家有沒有遇過這種問題：
: 雖然我知道不同廠牌的Tag，效果會不同
: 但是如果使用便宜的品牌，可以ｐ出product
: 反而使用qiagen無法ｐ出任何東西
: 這樣所ｐ出來的product可信嗎？
: （condition條件皆相同）
: 此外我還試過用此product稀釋後當template
: 然後用qiagen來ｐ還是不行
: 因為我將此product拿去做cloning，
: 出來的結果都是self ligation, （嘗試過多種insert:vector比例,歷經半年＞＿＜）
: 實在很好奇是不是此product根本不是正確的東西?還是cloning技術的問題?
有時候P不出來也有可能是primer有問題
之前我在clone一段基因時
不管是polymerase或是我的template
以及溫度我由35跑到65都跑過了[TM值60度]
該換的都換新的了，各條件也交叉測試，還是無法P出來
最後才發現是primer廠商那邊合錯了XD
整個脫力Orz
不過依照你的說法，primer似乎又是可以用....[因為有P出來]
但是最怕的就是會亂黏XD
所以最保險的還是送去定序好了^^
至於沒有insert....
你用enzyme切的時候建議分兩次切
像我的vector我是用SalI 還有 BamHI去切的
我都先用SalI切完後取一些出來跑電泳
如果只有1個band[表示有切開]才用第二種酵素下去切
至於酵素使用的先後順序
請小心評估所選酵素之buffer條件來決定!!
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◆ From: 59.114.184.156
推 ROKEE:說一下是哪間公司，以後列為拒絕往來戶 01/11 22:20
推 aggaci:我們lab訂明欣、生工都曾經合錯 01/11 23:40
推 Stephenmy:痾....我當初就是定2F說的前者XD 01/12 00:01
推 ROKEE:我們這邊也有人primer錯過,還連續2次,也是跟明欣訂的 01/12 00:47
推 blence:跟明欣訂過幾百條,目前只錯過一次,出錯機率不至於令人反感 01/12 18:03
推 ROKEE:我們歷來跟merk訂了幾百條，沒有錯過一次，十分令人滿意 01/12 18:24