→ shenhsu:還有可能是primer dimer 如果是的話請重新設計~ 06/14 15:02
推 HEK293:或是把Primer濃度弄再低一點 06/14 15:03
→ DJHINN:primer dimer 會形成很sharp的條帶嗎 @"@? 06/14 15:13
→ DJHINN:Melting point 都一樣耶 XD 06/14 15:13
→ DJHINN:而且看melting curve 僅有一個peak出現... 06/14 15:18
→ DJHINN:應該不是dimer的問題.....吧 XD 06/14 15:18
推 jabari:定序看看... 如果污染的話, 就說服自己primer設計得很靈敏 06/14 15:36
推 captdavince:很害怕汙染的話，建議改用UDG系統.換dUTP.enzymes 06/16 07:20
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作者: pocession (阿宗) 看板: Biotech
標題: Re: [討論] 關於housekeeping gene
時間: Tue Jun 14 23:56:52 2011
※ 引述《DJHINN (dj)》之銘言：
: 最近開始著手操作 real-time PCR
: 首先就利用 Actin primer pairs 這個 housekeeping gene 練練手
: 順便計算其 amplication efficiency
: 但是我發現
: 僅加水的對照組，卻也跑出相同的產物
: 於是第二次我就將所有東西都換新的
: 包括 1. real time PCR Mix solution
: 2. 新的稀釋過的 primer
: 3. 新分裝過的水
: 結果第二次結果...水仍然跑出產物
: 而且我將結果拿去跑電泳，水的對照組可以看到清楚的條帶 (同產物)
: 因為我們實驗室主要的材料對象是昆蟲，也常常會在冰桶上做研磨的動作
: 昆蟲有時也會飛出....
: 這樣有可能會到處汙染嗎? 由其是 housekeeping gene 這種超靈敏的 gene
: 不知道是否有前輩有遇過這樣的問題?
: 目前: 我重新將血清瓶洗滌過後，滅了新的 二次水
: 等一下會用一般PCR測試看看到底問題是不是出現在水上面...
會 這會到處污染
通常污染源是來自於放大後的產物，檢體中的量少，通常一般清潔方法就可以去除，
不太會累積
我覺得重點在跑電泳確認這個步驟，跑完後要確實去污
基本上電泳的器具和區域要和實驗完全隔離
且所有接觸到產物的器具使用完後要以1% 漂白水泡30分鐘再沖洗
另外，最好重訂所有藥品
然後確認藥品乾淨再做實驗，
重訂的藥品送來的時候先借別人的冰箱放
確認藥品可用，
先找認識的人借個乾淨的區域 (就是沒有操作類似檢體的地方)
在一天的開始 (就是身上還很乾淨沒有沾到產物的時候)
用PCR REAGENT裡面附的水配製，回溶所有藥品，
接著空跑幾個反應，確認有無產物，沒有的話這批藥品就可以使用
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 118.231.72.155
※ 編輯: pocession 來自: 118.231.72.155 (06/14 23:57)
推 DJHINN:謝謝大大詳盡的回答....這方面我會再多注意 06/15 18:08
推 elderbear:不知道你們實驗室再處理某些含DNA廢棄物(用過的plate等) 06/16 09:26
→ elderbear:是用專用的autoclave?還是共用autoclave?? 06/16 09:26
→ elderbear:我也有過類似的經驗,後來才發現autoclave處理後DNA 06/16 09:27
→ elderbear:degrade成碎片的大小 通常還是比real-time PCR產物大 06/16 09:28
→ elderbear:所以所用用那台autoclave出來的水或容器都會被汙染 06/16 09:28
→ elderbear:這方面是有文獻可參閱,不知有無幫助~? 06/16 09:29
推 DJHINN:是共用..autoclave... 不知道可否跟樓上要這篇文獻 06/16 14:31