[轉錄]Re: [問題] 請問我的cloning中vector contorl會長 …

[HIbaby (嗨北鼻)]

※ [本文轉錄自 Biology 看板]

作者: ad1980 (DREAMCHASER) 看板: Biology
標題: Re: [問題] 請問我的cloning中vector contorl會長 …
時間: Sun Nov 28 16:23:48 2004

※ 引述《sirius1980 (重要的日子,卻沒有重要的)》之銘言：
: ※ 引述《EITHEROR (藍藍天空)》之銘言：
: : 若vector沒切完全或是vector:insert的比例不對
: : 會促使vector容易自己黏回去
: : 如果vector是single cut的話.一定要做去磷酸化的動作喔
: : 否則會挑到死的~  :p
: : 可以做一組vector alone但不加ligase的對照組
: : 如果還是長很多.那就是沒切完全或有plasmid的contamination
: : 不過.最悽慘的事是insert會對E.coli造成毒性
: : 所以永遠接不進去~ (嗚..悽慘經歷~)
: : 也會造成contorl組長比較多的情況..
: : 通常是CMV promoter driven的時候啦~ ><
: 真的很謝謝板上各位朋友的熱心^^
: 我還是把我的情況詳細描述一遍
: 我是用XbaI跟EcoRV去處理我的vector
: (學長說這樣可以不用作CIA,如果enzyme都有work的話)
: 接著我的insert比較特殊,先order 2條ssDNA再annealing 為 dsDNA
: 這dsDNA只有40bp而已(這兩端都已經設計好有cutting site)
: 所以之後就直接ligation
: 接下來就是這種情況了.....> <

這讓我聯想到另一個問題想請教大家一下，
insert 太小或是 insert 和 vector 大小差太多
會不會比較難 ligate 起來阿？

我之前用 pGADT7 (for yeast two hybrid)
用了三種 inserts...
1kb 以上的 insert 都沒問題，
有一個 0.7kb 的 後面用 colony pcr check
十個 colonies 沒有一個有 insert...
我也有照 3:1 的比例，可是都做不成。
(pGADT7 = 8kb)
但是其他兩個 >1kb 的 insert 十個colonies
十個都有 insert....
我三個是一起做的，所以實驗過程應該是沒問題的。

那為什麼獨獨0.7kb那個做不出來呢？


謝謝。


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絕不做會讓自己後悔的事，
做了就不要後悔。


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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 142.179.1.38

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 219.1.156.27
推 blence:我也想知道,為什麼我用6.4kb+21bp接不起來
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 作者  HIbaby (嗨北鼻)                                      看板  Biotech     
 標題  Re: [轉錄]Re: [問題] 請問我的cloning中vector c …                      
 時間  Sun Nov 28 19:52:20 2004                                               
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我前一陣子耍笨 總之 最後變成5.4kb+50bp的ligation
不過還是接起來了
大小差距大真的很難接嗎? @@?

只是回收的時候很麻煩
                          
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◆ From: 219.1.156.27  
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 作者  aggaci (五子棋啦)                                    看板  Biotech     
 標題  Re: [轉錄]Re: [問題] 請問我的cloning中vector c …                      
 時間  Sun Nov 28 19:57:56 2004                                               
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※ 引述《HIbaby (嗨北鼻)》之銘言：
: 我前一陣子耍笨 總之 最後變成5.4kb+50bp的ligation
: 不過還是接起來了

  50bp?  ㄜ...這要怎麼做出來阿
  PCR嗎?
  唉   我cloning技術實在粉差...O_o
                                         
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◆ From: 140.114.100.165      
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 作者  HIbaby (嗨北鼻)                                      看板  Biotech     
 標題  Re: [轉錄]Re: [問題] 請問我的cloning中vector c …                      
 時間  Sun Nov 28 20:09:00 2004                                               
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※ 引述《aggaci (五子棋啦)》之銘言：
: ※ 引述《HIbaby (嗨北鼻)》之銘言：
: : 我前一陣子耍笨 總之 最後變成5.4kb+50bp的ligation
: : 不過還是接起來了
:   50bp?  ㄜ...這要怎麼做出來阿
:   PCR嗎?
:   唉   我cloning技術實在粉差...O_o
: : 大小差距大真的很難接嗎? @@?
: : 只是回收的時候很麻煩
  我是用pcr放大我要的片段 然後把這小片段先接到TA裡面去
  然後 從TA質體切出 在接到我的表現質體裡面
  這邊我用的小技巧
  就是我先切含有這小片段的700bp   
      Sca1                 HindIII     KpnI
       _________________________________
                                    target

  回收以後

  然後再用HindIII切， 經過一次酒精沈澱， 我就把這個混著兩段的東西
  接到我的表現質體的HindIII 和 KpnI site裡面

  挑了8個 中6個




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  PTT           統合生命科學研究院
Biotech         生物醫學研究所 幹細胞研究室
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◆ From: 219.1.156.27
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 作者  lilychyeh (做也做不完的實驗)                         看板  Biotech     
 標題  Re: [轉錄]Re: [問題] 請問我的cloning中vector c …                      
 時間  Tue Nov 30 00:52:50 2004                                               
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: 作者: ad1980 (DREAMCHASER) 看板: Biology
: 標題: Re: [問題] 請問我的cloning中vector contorl會長 …
: 時間: Sun Nov 28 16:23:48 2004
: 這讓我聯想到另一個問題想請教大家一下，
: insert 太小或是 insert 和 vector 大小差太多
: 會不會比較難 ligate 起來阿？
是的，當insert太小(<100bp)時，cloning的確會比較難做。
通常是因為「 insert：vector 的比例"太高"」，換言之就是insert太多了。
當insert太多時，容易發生好幾個insert同時競爭1個vector的情況，所以很難接入；
就算挑到接成功的colony，也往往是multi-insertion（1個vector接上好幾個insert）

遇到這種insert很小的cloning時，解決之道就是注意insert：vector的比例^^
如果是用PCR得到的insert，還勉強有可能用跑 DNA agarose gel的方式去判斷。
若是用兩條ssDNA anneal得到的產物ds DNA當insert時，請拿出紙筆，好好計算
insert：vector的莫耳數比^^

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以上，是之前本人失敗數次後，硬著頭皮請教老闆時得到的解答；   
（計算後，把insert稀釋100倍再重做，從原來的一顆colony也沒有變成了長整盤）
後來又經過多次實驗證明，證實insert濃度的確是關鍵 :p

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 218.160.159.45
推 yak138:insert:vecter大約是多少阿？
推 lilychyeh:我常用的比例是insert:vector=5:1~10:1
→ lilychyeh:我也做過3:1或20:1的，也是可行。
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 作者  genepark (勁公園)                                    看板  Biotech     
 標題  Re: [轉錄]Re: [問題] 請問我的cloning中vector c …                      
 時間  Tue Nov 30 16:06:54 2004                                               
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※ 引述《lilychyeh (做也做不完的實驗)》之銘言：
: 是的，當insert太小(<100bp)時，cloning的確會比較難做。
: 通常是因為「 insert：vector 的比例"太高"」，換言之就是insert太多了。
: 當insert太多時，容易發生好幾個insert同時競爭1個vector的情況，所以很難接入；
: 就算挑到接成功的colony，也往往是multi-insertion（1個vector接上好幾個insert）
: 遇到這種insert很小的cloning時，解決之道就是注意insert：vector的比例^^
       這樣子應該可以用double digestion,
       讓insert兩端的cutting site不一樣,
       當然, 當insert濃度太高的時候還是會接不起的.

: 如果是用PCR得到的insert，還勉強有可能用跑 DNA agarose gel的方式去判斷。
: 若是用兩條ssDNA anneal得到的產物ds DNA當insert時，請拿出紙筆，好好計算
: insert：vector的莫耳數比^^

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 140.109.17.41   
> --------------------------------------------------------------------------- <
 作者  ad1980 (DREAMCHASER)                                 看板  Biotech     
 標題  Re: [轉錄]Re: [問題] 請問我的cloning中vector c …                      
 時間  Tue Nov 30 16:25:37 2004                                               
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※ 引述《genepark (勁公園)》之銘言：
: ※ 引述《lilychyeh (做也做不完的實驗)》之銘言：
: : 是的，當insert太小(<100bp)時，cloning的確會比較難做。
: : 通常是因為「 insert：vector 的比例"太高"」，換言之就是insert太多了。
: : 當insert太多時，容易發生好幾個insert同時競爭1個vector的情況，所以很難接入；
: : 就算挑到接成功的colony，也往往是multi-insertion（1個vector接上好幾個insert）
: : 遇到這種insert很小的cloning時，解決之道就是注意insert：vector的比例^^
:         這樣子應該可以用double digestion,
:         讓insert兩端的cutting site不一樣,
:         當然, 當insert濃度太高的時候還是會接不起的.
: : 如果是用PCR得到的insert，還勉強有可能用跑 DNA agarose gel的方式去判斷。
: : 若是用兩條ssDNA anneal得到的產物ds DNA當insert時，請拿出紙筆，好好計算
: : insert：vector的莫耳數比^^

我之前就是用 double digestion，
比例是用 1:3，可是我不知道那算不算是莫耳數比。
教我的 post-doc 是這樣算的。
vector 8kb    
insert 0.7kb
vector: insert = (8/0.7):1 = 11:1
然後再依 conc 調成 3:1
所以如果 vector 用 50ng 的話，
insert 就會變很少 ng....

總之，最後就是接不出來。
但是 insert > 1kb  就可以。
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絕不做會讓自己後悔的事，
做了就不要後悔。
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◆ From: 142.179.1.38              
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 作者  Lipaty (月餅不要吃太多)                              看板  Biotech     
 標題  Re: [轉錄]Re: [問題] 請問我的cloning中vector c …                      
 時間  Tue Nov 30 22:03:26 2004                                               
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cutting sites不一樣還是會發生這種狀況

※ 引述《genepark (勁公園)》之銘言：
: ※ 引述《lilychyeh (做也做不完的實驗)》之銘言：
: : 是的，當insert太小(<100bp)時，cloning的確會比較難做。
: : 通常是因為「 insert：vector 的比例"太高"」，換言之就是insert太多了。
: : 當insert太多時，容易發生好幾個insert同時競爭1個vector的情況，所以很難接入；
: : 就算挑到接成功的colony，也往往是multi-insertion（1個vector接上好幾個insert）
: : 遇到這種insert很小的cloning時，解決之道就是注意insert：vector的比例^^
:         這樣子應該可以用double digestion,
:         讓insert兩端的cutting site不一樣,
:         當然, 當insert濃度太高的時候還是會接不起的.
: : 如果是用PCR得到的insert，還勉強有可能用跑 DNA agarose gel的方式去判斷。
: : 若是用兩條ssDNA anneal得到的產物ds DNA當insert時，請拿出紙筆，好好計算
: : insert：vector的莫耳數比^^        
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常用數學符號資料庫：
        ＋－×÷±⊕＝≒≠≡≡＜＞≦≧
        ∴∵∫∮∩∪㏑㏒√→∞∠△°
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