我是以PCR產物做ligation
vector以EcoRV切及ALK處理去掉磷酸基(NEB)
PCR產物經gel extraction處理後
以PNK(NEB)處理加上磷酸基再做blunt end的ligation(NEB)
PNK的說明書有一段文字是說
為了簡化步驟可以以ligase buffer取代PNK buffer
不需要再加ATP，作用半小時後，
不需再加熱inactive PNK,直接做ligation
我表達的可能不是很好，附上原文
Typically, PNK reactions are followed by a ligation reaction.
To simplify this process, PNK is optimized for use in T4 Ligase
reaction buffer (which contains the appropriate amount of ATP).
We recommend performing the PNK reaction in Ligase buffer for 30 minutes;
you can then proceed to ligation without a buffer change or heat inactivation.
可是vector以ALK處理過，照說明書做的話
不會再加上磷酸基嗎?這樣的話不會造成self-ligation嗎?
有人做過嗎?可不可以跟我說一下
先謝謝大家了。
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作者: YuChHa (YuChHa) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 做ligation時.polynucleotide kinaseꨠ…
時間: Wed Jun 29 19:07:58 2005
※ 引述《pwl (蓄勢待發)》之銘言：
: 我是以PCR產物做ligation
: vector以EcoRV切及ALK處理去掉磷酸基(NEB)
: PCR產物經gel extraction處理後
: 以PNK(NEB)處理加上磷酸基再做blunt end的ligation(NEB)
: PNK的說明書有一段文字是說
: 為了簡化步驟可以以ligase buffer取代PNK buffer
: 不需要再加ATP，作用半小時後，
: 不需再加熱inactive PNK,直接做ligation
: 我表達的可能不是很好，附上原文
: Typically, PNK reactions are followed by a ligation reaction.
: To simplify this process, PNK is optimized for use in T4 Ligase
: reaction buffer (which contains the appropriate amount of ATP).
: We recommend performing the PNK reaction in Ligase buffer for 30 minutes;
: you can then proceed to ligation without a buffer change or heat inactivation.
: 可是vector以ALK處理過，照說明書做的話
: 不會再加上磷酸基嗎?這樣的話不會造成self-ligation嗎?
會的
所你insert要加多一點(我指的是比例)
不管怎樣
vector一定會切不完全(RE的效率不可能100% 除非你vector也做Gel Extraction)
並且在ligation時
也多多少少會self-ligation
所以呀
你在ligation時
vector最好越少越好(但是vector:insert還是照比例)
例如用1:10 dilution的vector加0.5 uL到10 uL的ligation reaction
盡量減少vector only的transformation形成
到時候screen會比較方便
我大概挑四個可以中兩個成功的!!
: 有人做過嗎?可不可以跟我說一下
: 先謝謝大家了。
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