推 pacity:但是兩頭不是不一樣的cutting site嗎.. 140.129.74.200 09/03
→ pacity:還是你的self-ligation是多個vector接起來的喔@@" 140.129.74.200 09/03
推 liuse:嗯嗯對耶 我沒看清楚...sorry 218.35.5.18 09/03
> -------------------------------------------------------------------------- <
發信人: NTL7.bbs@bbs.wretch.cc (), 看板: Biotech
標 題: Re: construct... 求救
發信站: 無名小站 (Sat Sep 3 17:21:12 2005)
轉信站: ptt!Group.NCTU!grouppost!Group.NCTU!wretch
※ 引述《ubiquitin.bbs@nculs.twbbs.org.tw (goodday)》之銘言：
> vector : pCDNA ~ 5.5kb
> insert : 1.7 kb
> 兩者都以 EcoRI/ XhoI 處理後電泳挖下膠, clean up
> 之後再跑膠一次check 也都能看到 vector, insert 的 band
> 然後ligation RT overnight
> transform....
> 菌幾乎都長不起來
> 即使有長菌似乎全部都是 vector 的 self ligation > <
> 有人建議我要用 CIAP
> 但1.7kb 真有這麼難接ㄇ ?
> 弄了半個月過去了我快爆炸ㄌ!!
看來你的問題在於vector uncompletely cut.
pCDNA切一刀和切兩刀，size並沒有變化，建議你先切XhoI，
取一點點出來跑電泳，拿未切的pCDNA作對照，確定XhoI完全切乾淨之後再加入EcoRI
兩個小時之後再作elute，應該就可以了。
但前提是 1.兩個酵素都是有效的。
2.Insert兩端不是單一種切位。
--
夫兵者不祥之器物或惡之故有道者不處君子居則貴左用兵則貴右兵者不祥之器非君子
之器不得已而用之恬淡為上勝而不美而美之者是樂殺人夫樂殺人者則不可得志於天下
矣吉事尚左凶事尚右偏將軍居左上將軍居右言以喪禮處之殺人之眾以哀悲泣之戰勝以
喪禮處之道常無名樸雖小天下莫能臣侯王若能守之萬物將自賓天地相合以降甘露民莫
之令而自均始制有名名亦既有夫亦將知止知止可以不殆譬道之在天下140.109.32.9海
> -------------------------------------------------------------------------- <
作者: neo15 (愛上一個不該愛的人) 看板: Biotech
標題: Re: construct... 求救
時間: Sat Sep 3 20:54:30 2005
※ 引述《ubiquitin.bbs@nculs.twbbs.org.tw (goodday)》之銘言：
: vector : pCDNA ~ 5.5kb
: insert : 1.7 kb
: 兩者都以 EcoRI/ XhoI 處理後電泳挖下膠, clean up
: 之後再跑膠一次check 也都能看到 vector, insert 的 band
: 然後ligation RT overnight
: transform....
: 菌幾乎都長不起來
: 即使有長菌似乎全部都是 vector 的 self ligation > <
: 有人建議我要用 CIAP
: 但1.7kb 真有這麼難接ㄇ ?
: 弄了半個月過去了我快爆炸ㄌ!!
想請問你的Insert是如何prepare
由PCR直接夾出來的?還是由另一個vector切出來的?
如果是用PCR prepare的話，建議你將insert 拿去sequensing,
因為我曾經發生過primer 合成出錯，還剛好是壞在cut site ~
所以根本接不上去 vector上~
除此之外，你也可以試著先將 insert 接到 TA vector中 再接到pCDNA
我曾經利用TA vector接過3k的insert(半個月)
而實驗室學姐用PCR接了一年接不上去 Orz
再著，利用E.coli prepare insert 質好量大又不容易出錯，
你可以買國產的TA vector，一組Kit 才NT 1800~
試試看吧~~~
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 220.130.135.46
> -------------------------------------------------------------------------- <
作者: quark225 (想到再填) 看板: Biotech
標題: Re: construct... 求救
時間: Sat Sep 3 22:01:43 2005
※ 引述《ubiquitin.bbs@nculs.twbbs.org.tw (goodday)》之銘言：
: vector : pCDNA ~ 5.5kb
: insert : 1.7 kb
: 兩者都以 EcoRI/ XhoI 處理後電泳挖下膠, clean up
: 之後再跑膠一次check 也都能看到 vector, insert 的 band
: 然後ligation RT overnight
: transform....
: 菌幾乎都長不起來
: 即使有長菌似乎全部都是 vector 的 self ligation > <
: 有人建議我要用 CIAP
: 但1.7kb 真有這麼難接ㄇ ?
: 弄了半個月過去了我快爆炸ㄌ!!
ligation RT overnight太久了啦....
我接過13kb的insert, ligation at room temperature for 2 hours
還有我發現 transformation的條件也是會有影響的..
別灰心, 套句學長說的:做cloning都很順代表做太少cloning
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 218.165.103.161
> -------------------------------------------------------------------------- <
作者: ROKEE (..) 看板: Biotech
標題: Re: construct... 求救
時間: Sun Sep 4 19:27:00 2005
※ 引述《neo15 (愛上一個不該愛的人)》之銘言：
: 想請問你的Insert是如何prepare
: 由PCR直接夾出來的?還是由另一個vector切出來的?
: 如果是用PCR prepare的話，建議你將insert 拿去sequensing,
: 因為我曾經發生過primer 合成出錯，還剛好是壞在cut site ~
: 所以根本接不上去 vector上~
: 除此之外，你也可以試著先將 insert 接到 TA vector中 再接到pCDNA
: 我曾經利用TA vector接過3k的insert(半個月)
: 而實驗室學姐用PCR接了一年接不上去 Orz
: 再著，利用E.coli prepare insert 質好量大又不容易出錯，
: 你可以買國產的TA vector，一組Kit 才NT 1800~
: 試試看吧~~~
借個標題喔...
之前我要把某物種的DNA用EcoRI切下後的片段接到可提供定序功能的vector上
可是切下來的片段很大 一個4.5kb、一個5.7kb、一個7.0kb
我有嘗試用CIPA處理EcoRI切過的vector
(這2.1kb的vector帶有M13R和M13F site，還可以藍白篩)
長出來幾乎都是藍的... 就這樣做了2個月
(insert和vector比例我做過10:1、5:1、3:1、1:1)
後來我同學教我一招
就是把切EcoRI回收的片段用ProTaq+10xbuffer+dNTP作用72℃一小時
(就是補成blunt end後再加A)
再接到3.0kb的T-vector上
(T-vector可以藍白篩，也有SP6和T7 promoter site供定序之用)
可惜我接到4.5kb的片段後其他就再也拿不到了...:(
請問版上各位前輩們，能提供小弟一點方式嗎?
不然做了3個月只為了接這3個片段...唉
thanx!!
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 61.225.200.149
> -------------------------------------------------------------------------- <
發信人: terrences.bbs@bbs.sa.ncyu.edu.tw ( ), 看板: Biotech
標 題: Re: construct... 求救
發信站: 新綠園 (Sun Sep 4 21:21:07 2005)
轉信站: ptt!Group.NCTU!grouppost!Group.NCTU!ncyusa
※ 引述《ubiquitin.bbs@nculs.twbbs.org.tw (goodday)》之銘言：
> vector : pCDNA ~ 5.5kb
> insert : 1.7 kb
> 兩者都以 EcoRI/ XhoI 處理後電泳挖下膠, clean up
> 之後再跑膠一次check 也都能看到 vector, insert 的 band
> 然後ligation RT overnight
> transform....
> 菌幾乎都長不起來
> 即使有長菌似乎全部都是 vector 的 self ligation > <
> 有人建議我要用 CIAP
> 但1.7kb 真有這麼難接ㄇ ?
> 弄了半個月過去了我快爆炸ㄌ!!
1.ligation方面
可以用16度 18小時
或是 14度 24小時
增加ligation成功率
2.transformation方面
ligation後的產物dilute 5X
再transformation..
3.另外若做CIAP，做完後最好再clean一次，去除protein和離子
--
╭─ Origin ─╗ 新綠園 bbs.sa.ncyu.edu.tw ～ κλμ ─┤
├ Author ╡ 61-62-241-244-adsl-tan.static.so-net.net.tw
> -------------------------------------------------------------------------- <
發信人: ubiquitin.bbs@nculs.twbbs.org.tw (goodday), 看板: Biotech
標 題: Re: construct... 求救
發信站: 生生不息 (Fri Sep 9 02:20:41 2005)
轉信站: ptt!Group.NCTU!grouppost!Group.NCTU!nculs
※ 引述《terrences.bbs@bbs.sa.ncyu.edu.tw ( )》之銘言：
> ※ 引述《ubiquitin.bbs@nculs.twbbs.org.tw (goodday)》之銘言：
> > vector : pCDNA ~ 5.5kb
> > insert : 1.7 kb
> > 兩者都以 EcoRI/ XhoI 處理後電泳挖下膠, clean up
> > 之後再跑膠一次check 也都能看到 vector, insert 的 band
> > 然後ligation RT overnight
> > transform....
> > 菌幾乎都長不起來
> > 即使有長菌似乎全部都是 vector 的 self ligation > <
> > 有人建議我要用 CIAP
> > 但1.7kb 真有這麼難接ㄇ ?
> > 弄了半個月過去了我快爆炸ㄌ!!
> 1.ligation方面
> 可以用16度 18小時
> 或是 14度 24小時
> 增加ligation成功率
> 2.transformation方面
> ligation後的產物dilute 5X
> 再transformation..
> 3.另外若做CIAP，做完後最好再clean一次，去除protein和離子
感謝各位
總算做出來ㄌ > <
--
◤◥ Origin: 中央生科˙生生不息 nculs.twbbs.org.tw
◣◢ Author: ubiquitin 從 140.109.40.71 發表