推 mengyichen:妳可以接完切一刀，然後和沒有接的切一刀來比 10/02 17:00
→ mengyichen:不過我們實驗室都是用PCR去確認後，就就送定序了 10/02 17:00
推 ROKEE:樓上好野人... 10/02 17:46
推 YuChHa:真有錢!! 10/02 17:47
推 mengyichen:那請問一下，不定序的話，怎知接到的序列一定正確呢 ? 10/02 18:23
推 YuChHa:你總要先知道有接進去再定序吧 因為送vector去定序很有錢 10/02 18:47
推 mengyichen:所以說……先用 PCR確認過了嘛~~ 10/02 19:10
推 ROKEE:我們lab是RE切完確定有把insert塞入才會送定序 10/02 20:30
→ ROKEE:送定序不過才幾百元 還好啦 XDDDDD 10/02 20:30
→ allmerit:感謝大家的幫忙 10/03 12:57
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作者: YuChHa (愛情 科學 金錢) 看板: Biotech
標題: Re: 請問一下跑質體電泳的問題
時間: Sun Oct 2 17:47:19 2005
※ 引述《allmerit (ring)》之銘言：
: 請問大家
: 質體的構型不是會影響他泳動的速率
: 那是不是就無法從電泳結果確定未切割過的質體大小了呢?
: 因為我想做ligation insert是500 b.p , vector是5 kb
: 我很怕接完之後5.5kb跟原本的5 kb會看不出來到底 ligation有沒有成功
: 我有看過paper上使用supercoiled form的DNA marker
: 不知道有沒有人使用過 效果好嗎?可能分的清5.5跟5 kb的差異嗎
: 感激您的幫忙 謝謝 !!
如果運氣好的話
找一個 insert 有的 cutting site
但是 vector 沒有的
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"台灣大學" I don't give a shit.
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◆ From: 59.121.154.63
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作者: royta (睡不著...) 看板: Biotech
標題: Re: 請問一下跑質體電泳的問題
時間: Mon Oct 3 03:29:58 2005
建議你用PCR check，其實花費並不會比用RE check來的貴..
況且你只需要使用20ul PCR的體積..就可以得知結果..
colony PCR check可以使用較便宜的Taq..用你放大insert的primer與PCR條件即可..
run 20個cycles就夠了..
但是..你的基因不可以是E.coli本身就具有的基因..不然會有結果誤判發生..
如果是上述情形，就必須使用vector上的primer來進行PCR..
RE check需要先養菌再抽出plasmid DNA..接著進行digestion..
時間..花費..你可以衡量一下^^
※ 引述《allmerit (ring)》之銘言：
: 請問大家
: 質體的構型不是會影響他泳動的速率
: 那是不是就無法從電泳結果確定未切割過的質體大小了呢?
: 因為我想做ligation insert是500 b.p , vector是5 kb
: 我很怕接完之後5.5kb跟原本的5 kb會看不出來到底 ligation有沒有成功
: 我有看過paper上使用supercoiled form的DNA marker
: 不知道有沒有人使用過 效果好嗎?可能分的清5.5跟5 kb的差異嗎
: 感激您的幫忙 謝謝 !!
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◆ From: 140.109.249.116
推 ROKEE:萬一insert很長 萬一沒有剛好合用的primer 萬一.... 10/03 04:29
推 royta:你都可以用primer把insert夾出來了,insert長度應該不是問題 10/03 11:07
→ royta:一般的vector都會有它本身的primer啦..不然你怎麼定序.. 10/03 11:10
推 allmerit:太感激你了^^ 10/03 12:56
推 ROKEE:難講ㄟ 我們lab送定序的公司就沒有pQE、Para,etc.. primer 10/03 20:57
→ ROKEE:便宜的Taq能夾到4~5k就要偷笑了 10/03 20:57
推 royta:4~5k...夠你用的啦...定序公司沒有pQE..可以考慮換一家 10/03 21:55
推 ROKEE:well,我想強調的是抽plasmid搭配RE幾乎試用於所有接clone的ꨠ 10/05 01:36
→ ROKEE:狀況，而用PCR做check受到的限制會比較多 10/05 01:37
推 ROKEE:上面也有人說，萬一菌體chromosome上剛好... 不就完蛋? 10/05 01:39
推 royta:如果...做實驗有那麼多萬一...真的是夠帶賽了.. 10/05 13:29
→ royta:如果你有20顆colony要check..那豈不要抽20次的plasmid DNA? 10/05 13:30
→ royta:時間...花費...效率....可供大家來評論... 10/05 13:33
推 royta:謝謝你的指教^^ 10/05 13:49
推 ROKEE:我做一次transform 塗1~2盤 每盤最多挑5顆 10/06 00:06
→ ROKEE:都沒有的話寧願重做 10/06 00:06
推 royta:一次做5個S.D.M..豈不要抽plasmid DNA=>5種x2盤x5顆=??次.. 10/06 19:21
→ royta:我說的20顆不是挑同一盤啦... 10/06 19:35
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作者: bee1718 () 看板: Biotech
標題: Re: 請問一下跑質體電泳的問題
時間: Thu Oct 13 06:16:33 2005
我們的作法是
先把菌養起來
用 3% SDS pH12.6 的 buffer 溶一點點菌塊
然後
phenol-chloroform 萃一下
離心兩分鐘
取上層直接跑電泳
這邊有點小竅門兒啦新手不太會用
這樣可以直接判讀未切的 plsmid 大小
但是因為解像力不好0.5k 我還可分的出來
低於這個就很難分
我的紀錄是分出0.3k
剛開始會做不出來
我們做習慣以後大量篩菌的時猴就用這個方法挑
※ 引述《allmerit (ring)》之銘言：
: 請問大家
: 質體的構型不是會影響他泳動的速率
: 那是不是就無法從電泳結果確定未切割過的質體大小了呢?
: 因為我想做ligation insert是500 b.p , vector是5 kb
: 我很怕接完之後5.5kb跟原本的5 kb會看不出來到底 ligation有沒有成功
: 我有看過paper上使用supercoiled form的DNA marker
: 不知道有沒有人使用過 效果好嗎?可能分的清5.5跟5 kb的差異嗎
: 感激您的幫忙 謝謝 !!
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