推 blence:在3185上多切一個unique site 220.133.130.76 04/05
→ littlesky:原po 很明顯搞錯方向了.. 140.109.64.75 04/05
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發信人: ANUS.bbs@bbs.badcow.com.tw (平凡無奇默默無聞), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題]如何分離差距1000bp的兩段DNA
發信站: 不良牛牧場 (Tue Apr 5 15:34:47 2005)
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你跑電泳的時間多長?
時間拖長一些 可以將兩條band拉開些
因為你的片段還不小
所以可以跑到讓dye跳海再看看是否有拉開
我以前跑0.8%的這兩個位置還是可以分開
試試延長電泳時間吧!
※ 引述《ribose.bbs@ptt.cc (保濟丸)》之銘言：
: 我要做cloning
: 我先以XbaI/EcoRI 切我的plasmid
: 此時會分離出 4319 和 3185 bp 的兩段linear DNA
: 我去跑 0.7% 的 agarose gel
: 再將 4319 bp 那條 gel purify 出來
: 接著將 insert (200 bp)和4319 bp進行 ligation 和 transformation
: 但問題來了
: 經酵素確認後發現
: 所得的plasmid 皆是 4319 和 3185 bp 的兩段linear DNA 接起來的產物
: 所以我懷疑會不會是我gel purify 的不夠乾淨
: 因為gel purify 跑膠時 4319 和 3185 bp 的兩段linear DNA 離的很近
: 所以會不會可能去切到了 3185 bp 的這條DNA
: 因此我再進行一次 purify, ligation 和 transformation
: 但是還是得到4319 和 3185 bp 的兩段linear DNA 接起來的產物
: 請教各位
: 要跑多少濃度的agarose gel
: 才能將 4319 和 3185 bp 分離的比較開
: 不想再浪費時間啦
: 謝謝
--
(\~~/) (\~~/) Stop mooning over her,
(#>_<#) (*^.^*) ,she's way out of your league.
~(_)__) (_(__)~ 不要再對她痴心妄想了，你完全配不上她的。
I know that,
but I just can't help it.
我知道，可是我就是忍不住嘛。 個人版: anus
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發信人: lighty.bbs@ptt3.cc (fish), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題]如何分離差距1000bp的兩段DNA
發信站: 批踢踢參 (Tue Apr 5 15:57:32 2005)
轉信站: ptt!Group.NCTU!grouppost!Group.NCTU!ptt3
:
[cut]
我先以XbaI/EcoRI 切我的plasmid
: 此時會分離出 4319 和 3185 bp 的兩段linear DNA
: 我去跑 0.7% 的 agarose gel
: 再將 4319 bp 那條 gel purify 出來
: 接著將 insert (200 bp)和4319 bp進行 ligation 和 transformation
[cut]
我想到的辦法是:
1. 破壞3185bp--by other enzyme, 讓它變的更小,且不會干擾ligation
2. 用1% gel run久一點,then increase insert in the ligation reaction.
二擇一
Good Luck.
--
※ 發信站: 批踢踢參(ptt3.cc)
◆ From: 140.109.49.152
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作者: Highwind (小羊回來了) 看板: Biotech
標題: Re: [問題]如何分離差距1000bp的兩段DNA
時間: Tue Apr 5 16:54:25 2005
※ 引述《ribose (保濟丸)》之銘言：
: 我要做cloning
: 我先以XbaI/EcoRI 切我的plasmid
: 此時會分離出 4319 和 3185 bp 的兩段linear DNA
這邊我看不懂
因為沒有map,我猜你是切掉中間不要的約1K多吧
: 我去跑 0.7% 的 agarose gel
: 再將 4319 bp 那條 gel purify 出來
你為什麼要這一條?
: 接著將 insert (200 bp)和4319 bp進行 ligation 和 transformation
上面是我不太懂的
你會不會拿到沒切的circular form
以上純粹亂講,講錯就不要當真
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: 但問題來了
: 經酵素確認後發現
: 所得的plasmid 皆是 4319 和 3185 bp 的兩段linear DNA 接起來的產物
所以你做出7K多的,4K夾3K,光想就很難做,何況還有一大票insert競爭
怎麼想都很怪
: 所以我懷疑會不會是我gel purify 的不夠乾淨
: 因為gel purify 跑膠時 4319 和 3185 bp 的兩段linear DNA 離的很近
: 所以會不會可能去切到了 3185 bp 的這條DNA
: 因此我再進行一次 purify, ligation 和 transformation
: 但是還是得到4319 和 3185 bp 的兩段linear DNA 接起來的產物
: 請教各位
: 要跑多少濃度的agarose gel
: 才能將 4319 和 3185 bp 分離的比較開
其實差了1K已經很多了
用0.5%~1%應該都能分的開,而且應該是很開的那種
因為我看不太懂 你的敘述
所以會認為你認錯切錯band
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.122.227
※ 編輯: Highwind 來自: 140.112.122.227 (04/05 16:56)
推 Lipaty:你應該重新讀一次2795篇。 218.167.43.116 04/05
→ Lipaty:根本搞錯原po的意思 218.167.43.116 04/05
推 apa9394:恩...是ccc form切兩刀變兩條... 140.129.72.15 04/05
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發信人: hsd0.bbs@bbs.ym.edu.tw (恆星的恆心), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題]如何分離差距1000bp的兩段DNA
發信站: 陽明大學神農坡資訊站 (Tue Apr 5 21:32:33 2005)
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> : 但問題來了
> : 經酵素確認後發現
> : 所得的plasmid 皆是 4319 和 3185 bp 的兩段linear DNA 接起來的產物
> 所以你做出7K多的,4K夾3K,光想就很難做,何況還有一大票insert競爭
> 怎麼想都很怪
其實還好耶 因為我想那些原本就是有sticky end 所以原本EcoRI跟XbaI的
會self ligation的可能性不會說太小說~~~~~ 而且我猜他沒做CIP吧
> 其實差了1K已經很多了
> 用0.5%~1%應該都能分的開,而且應該是很開的那種
> 因為我看不太懂 你的敘述
> 所以會認為你認錯切錯band
對啊對ㄚ 其實要是普通的gel 應該可以分蠻開沒錯
不過我想知道你做的gel purification是不適用low melting gel阿??
如果是的話那可能有點麻煩 因為那種gel就你這各情況那兩條應該很近的樣子我想
上面幾篇有人提到把那個3K的DNA再找一個可以切一刀 但又不傷到4319bp的enzyme
這方法野是我想推薦的喔 但是如果阿 你沒找到的話 其實我建議你可以把切下來的
vector做CIP 那麼就算你有切到3185bp的也沒關係 但是有點麻煩的就是可能挑clone
的時候可能還是會遇到3185+insert的情形發生喔 所以相對的會難挑一點
---
但是我想問一個問題耶抱歉....你是切什麼東西需要把vector這樣切兩半阿
平常把insert塞入vector不都是切multiple cloning site嗎
普通的MCS大小也不至於這麼大吧.....請麻煩解答依下 謝謝了^_^a
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勇氣的 Ella 陳嘉樺 ╔╦═╮╔╗ ╔╗ ╭══╮
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男孩子氣的Ella 個性獨立思想成熟 愛打籃球的她 更是「S.H.E女朋友」的隊長
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發信人: ROKEE.bbs@bbs.badcow.com.tw (死胖子超怕熱), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題]如何分離差距1000bp的兩段DNA
發信站: 不良牛牧場 (Tue Apr 5 23:15:06 2005)
轉信站: ptt!Group.NCTU!grouppost!Group.NCTU!SimFarm
※ 引述《Lipaty.bbs@ptt.cc (說想說的話 吧)》之銘言：
: ※ 引述《ribose (保濟丸)》之銘言：
: : 我要做cloning
: : 我先以XbaI/EcoRI 切我的plasmid
: : 此時會分離出 4319 和 3185 bp 的兩段linear DNA
: : 我去跑 0.7% 的 agarose gel
: : 再將 4319 bp 那條 gel purify 出來
: : 接著將 insert (200 bp)和4319 bp進行 ligation 和 transformation
: 請教一下，哪個vector的multiple cloning sites這麼長？
: 有1134bp這麼誇張。
說不定原po是要自己construct一個新vector...
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→ apa9394:那是條艱辛的的路...挑clone阿.... 140.129.72.15 04/05
→ apa9394:每次paper在最後面都會提到此vector is a gift 140.129.72.15 04/05
→ apa9394:from Dr. XXX... 140.129.72.15 04/05
→ apa9394:為何vector是禮物...因為自己construct的gene送 140.129.72.15 04/05
→ apa9394:不進啊... 140.129.72.15 04/05
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發信人: hsd0.bbs@bbs.ym.edu.tw (恆星的恆心), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題]如何分離差距1000bp的兩段DNA
發信站: 陽明大學神農坡資訊站 (Wed Apr 6 01:11:00 2005)
轉信站: ptt!Group.NCTU!grouppost!Group.NCTU!YM
※ 引述《ROKEE.bbs@bbs.badcow.com.tw (死胖子超怕熱)》之銘言：
> ※ 引述《Lipaty.bbs@ptt.cc (說想說的話 吧)》之銘言：
> : 請教一下，哪個vector的multiple cloning sites這麼長？
> : 有1134bp這麼誇張。
> 說不定原po是要自己construct一個新vector...
如果是這樣的話....所以insert可能是一個antibiotic-resistant gene嗎>?
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勇氣的 Ella 陳嘉樺 ╔╦═╮╔╗ ╔╗ ╭══╮
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標 題: Re: [問題]如何分離差距1000bp的兩段DNA
發信站: 無名小站 (Thu Apr 7 16:40:00 2005)
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不曉得你實驗的問題解決了沒有？
根據你的描述，我有幾個建議，1.切完EcoRI和XhoI，跑電泳時要加marker，
確定切的很乾淨，有時候兩條band代表的是切一刀跟supercoil form這兩條。
2.lighty的建議很好，找一個3k有，4k沒有的restriction cutting site，
再多切一刀，這樣就會變成4k和 2k加1k，可以分的比較開，切膠時就不會切
到不要的band, 還是建議你用0.8%的膠，跑久一點，第一條dye跳海之後，應
該可以分的很清楚。
3.你新的insert太小，很可能又發生第一個盲點。也就是說，你已經clone到
正確的insert, 只是check時，restriction enzyme沒切完全，supercoil form
的plasmid讓你誤以為是3k的band.假如你是用RI/XhoI check insertion，可能
需要用濃一點的膠來跑，才看的出來，但最好還是選RI或XhoI外面的cutting
site比較好。
by雞婆的NTL7
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夫兵者不祥之器物或惡之故有道者不處君子居則貴左用兵則貴右兵者不祥之器非君子
之器不得已相簿 http://www.wretch.cc/album 有佈景主題 速度很快 可得志於天下
矣吉事尚左凶事尚右偏將軍居左上將軍居右言以喪禮處之殺人之眾以哀悲泣之戰勝以
喪禮處之道常無名樸雖小天下莫能臣侯王若能守之萬物將自賓天地相合以降甘露民莫
之令而自均始制有名名亦既有夫亦將知止知止可以不殆譬道之在天下140.109.32.9海
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發信人: mcr.bbs@ptt3.cc (lowly intern, resigning), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題]如何分離差距1000bp的兩段DNA
發信站: 批踢踢參 (Thu Apr 7 18:10:34 2005)
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: 我去跑 0.7% 的 agarose gel
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: 所得的plasmid 皆是 4319 和 3185 bp 的兩段linear DNA 接起來的產物
: 所以我懷疑會不會是我gel purify 的不夠乾淨
以下略
我建議你可以把那切出來的4319 以Alkaline Phosphatase 處理過
把5'的phosphate groups弄掉 這樣一來self-ligation會大幅減少
有利於你那200 bp insert的subcloning
要不然只要有極少量的那些3185pb存在 4319和3185就會快樂的ligate回去了
很多家有賣
http://bio.takara.co.jp/BIO_EN/catalog_d.asp?C_ID=C1227
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