推 sisyphus:先做SEQUENCE確定有問題再來擔心吧~~ 09/02 10:16
推 Highwind:本末到置了吧,另外single clone哪來的mutation問題 09/02 10:16
推 mojimoji:就是做了sequencing發現有mutation啊！因為orf很長 所以 09/02 12:59
推 mojimoji:不想重新PCR重接 想直接拿有mutation的plasmid當template 09/02 13:01
→ mojimoji:PCR短片段接回去 09/02 13:01
→ aggaci:有多挑幾顆定序嘛？ 09/02 13:56
推 intotheman:用一般的Quickchange方法 設計primer 用pfu去PCR 09/02 14:23
→ intotheman:如果mutation太多 你還是重新check你來源的gene是不是 09/02 14:23
→ intotheman:問題,or 事RT-PCR過來的? 有時後多做幾個點突變 不會 09/02 14:24
→ intotheman:比再接一次clone輕鬆 09/02 14:25
推 sisyphus:如果長到難免會出現mutation的長度..mutation完出現新的 09/02 15:47
→ sisyphus:你們準備怎麼辦? 09/02 15:48
→ sisyphus:不如多挑幾個去sequencing 找到對為止 09/02 15:48
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作者: mojimoji 看板: Biotech
標題: Re: [方法] 如何對plasmid做site-directed mutation ?
時間: Sat Oct 20 02:15:46 2007
※裡面吃掉 methylated template 似乎也可以交給 DpnI, 如果沒有特殊菌株的話... )
: 是比較建議:
: 1. 確認 template 來源單一. 比如說拿來 PCR 的 template 重新畫開挑
: single colony 抽 plasmid 用來做為重新 PCR 的 template.
: 2. 確認實驗的目的, 烏鴉不清楚你要 clone 的 gene 為什麼要重新 PCR,
: 所以下面只是猜測... 如果說是因為 cutting site 的問題, 要做不一樣的
: cutting site 好進行 sub cloning, 那建議可以只 PCR 前面一小段,
: 然後接回去舊的 vector 後再整段剪下來去進行 sub clone...
: 3. 如果排除了烏鴉上面可能的猜測, 非得整段進行 PCR 不可,
: 那可以...
: 3A. 重新 PCR, 重新接, 瘋狂送 Sequence...
: 3B. 檢查之前送定序結果的東西在 mutant 附近有沒有 cutting site 可以
: 進行剪接, 看看那麼多 sample 之中有沒有可以用來互相彌補的.
: 如果為了老闆要拼業績, 這是可以與 3A 同步進行的.
: 3C. 不顧一切的去訂 primer, 用 site-directed mutation 的方法一個個改回來...
: 當然, 烏鴉也是比較不建議 3C 的...
我現在的想法是分段做pcr然後再接起來
畢竟越短的錯誤機率越低
可是還沒想到要怎麼分段做
兩個pcr片段可以直接接起來嗎？(先變成一個大的insert)甚至多個接成長片段
再一起接到vector中 感覺起來就算可行 efficiency也超低
瘋狂送 Sequence我會被砍死啦！
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◆ From: 61.230.179.75
※ 編輯: mojimoji 來自: 61.230.179.75 (10/20 02:21)
推 leondemon:分開再接跟全部PCR的錯誤率是一樣的..... 10/20 13:16
推 leondemon:除非分開PCR 定序後 再接起來.... 10/20 13:20
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作者: Crow22312 (烏鴉) 看板: Biotech
標題: Re: [方法] 如何對plasmid做site-directed mutation ?
時間: Sat Oct 20 05:44:48 2007
全部打完了才想到, 就算下面都懶得看也沒關係,
這句比較重要:
Ligation 接起來的東西因為機率 所以量少,
因為量少所以需要馬上丟去 transform 給 E.coli 去放大...
然而 linear 的東西是不被 E.coli 接受的.
所以... PCR product + PCR product ligation 的放大...
****
晚上又失眠, 火氣有點大一個不小心就把自己的東西給砍了...
好吧, 那時候烏鴉想的是...
烏鴉是猜啦, 大概是類似這樣子:
----|---------------|----- pUC18
EcoRI (target) PstI
好了, 上面那是別人給你的, 或許是某個 cDNA clone, 然後老闆想研究這東西.
於是乎想改接到 pcDNA3.1 之類的裡面, 只是 pcDNA3.1 你想接的位置剛好不是
EcoRI 跟 PstI, 所以你想要用 PCR 方式製作切位, 好方便接到 pcDNA3.1 裡面.
( 我都亂舉的, 有沒有那些 cutting site 我懶得去查 =____=" )
^^^^^^^^^^
分段 PCR 的意思在這邊就是說...
NotI XhoI
----|---------|-------------|---------|-----
EcoRI PstI
|<-----------(target)---------->|
比如說你要 PCR 的東西裡面有兩個 unique cutting site:
NotI 與 XhoI 很幸運的就在開頭跟結尾附近.
那就這樣子啦...
__
\-- <- primer #1 with HindIII cutting site
----|---------|-------------------------------
EcoRI ---- <- primer #2
Primer #2 離 NotI 遠一點會比較好, 因為到時候要切,
沒留足夠的長度 enzyme 會不好切; 但是太遠也沒必要.
這樣子下去就會得到:
HindIII NotI
---|---------|----
的小片段; 然後同樣的 primer #3 primer 4# 可以去弄出尾巴的小片段.
不過當然不是三個片段切一切拿去做 ligation...
把三個片段成功 ligation 起來的運氣留著買樂透的時候用比較實際.
扯歪了, 找個類似這樣子的 vector 當中間人:
HindIII (與 EcoRI 不重疊)
---|---|--- // ---|---
EcoRI XhoI 或 PstI
先把你原本有的東西用 EcoRI 跟後面兩個挑一個的位置接近去,
( 或 XhoI, 不重要, 反正多的往後
EcoRI NotI PstI 都要除掉. 後面假設挑了 PstI )
----------|---|-----|---------------|--------------
HindIII
-- plasmid -->|<----- target ------>|<-- plasmid --
然後切掉要置換的, 純化, 變成..
HindIII PstI NotI
|------- // -------|--------------|
|<---------------->|<------------>|
plasmid DNA 去頭target
呼... 好了, 可以跟前面提到 PCR 出來的小開頭片段相接了...
這樣子就換好頭了, 同樣的可以把 primer #3 #4 PCR 的尾巴也換進去,
最後, 就會達成換頭的目的, 切下來在接近去你真正想要的 vector 裡面...
其實不是什麼大難想法, 只是 BBS 不好畫圖(圓形) + 烏鴉表達能力不好罷了...
希望烏鴉寫的東西對你有幫助.
對了, 在最後面突然就很想寫...
烏鴉是這樣子想的...
年齡跟老不老鳥是沒什麼的.
老鳥, 某些實驗你做的很好, 沒什麼了不起,
只不過是你比我早接觸, 碰的次數比我多, 這很正常.
要自己留招就算了, 不需要你的 " 哎喲, 連這都不會, 回去翻課本吧 "
要也請給我是哪本課本跟頁數.
年齡, 就算你比我年輕, 以前某方面實驗你做的比我多,
那你的身上自然有我可以學習的地方, 跟你學沒什麼不好;
即使只是學些實驗之外的巧思也是很好的.
重要的是你有沒有在思考, 有沒有想要更好.
知道的, 有空的: 歡迎請說.
不想幫也沒關係, 但冷嘲熱諷這類即使只是表情也就都免了.
在你看來 " 基本 " 的東西, 對別人不一定基本.
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◆ From: 122.127.3.11
→ Crow22312:千金文 ._.|| 10/20 06:03
推 tsubasawolfy:接接樂=w= 10/20 09:20
推 HIbaby:辛苦了! 10/20 10:00
推 linzhengzhan:最近也在做這樣子的實驗，光是設計，就快“起肖“了 10/20 15:56
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作者: HIbaby (嗨北鼻) 看板: Biotech
標題: Re: [方法] 如何對plasmid做site-directed mutation ?
時間: Sat Oct 20 10:00:34 2007
※ 引述《mojimoji (Tim)》之銘言：
:我CLONE了一個gene進去plasmid中
:不過因為是pcr product所以難免有mutation
:請問要如何利用點突變的方法把他改回來呢
:有沒有可以參考的文章 謝謝!
看到這一大串討論
提出我的做法
1. 請使用可以proof reading的polymerase來作
2. 如果是從A質體換到B質體 儘可能用切的
如果沒有適合的切位
我會想辦法 從 A 先換到 適合的 C 在從C 接回B
3. 萬一沒有template來源 也就是都要從 cDNA來增幅片段
那萬一這次發現mutation
請從PCR 步驟開始重作
因為同一批的PCR做出來的clone 可能mutantion的位置都一樣
最後再如板友所說 用切跟接
如果長度太長 就分段增幅再接
4. 建議不要做point mutation方式修回 因為又要用到PCR步驟 有很多風險
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◆ From: 133.11.50.177
※ 編輯: HIbaby 來自: 133.11.50.177 (10/20 10:04)
推 transmore:推一個 10/20 13:14
推 leondemon:推第三點 很受用唷～ 10/20 13:42
推 blence:第三點,理論上同樣一批做的clone有同樣的mutation,那就該懷 10/20 14:48
→ blence:疑cDNA或template本來就是有問題了,因為要來的,買來的EST 10/20 14:50
→ blence:clones,甚至自己做的細胞株cDNA,跟database總是有可能不一 10/20 14:56
推 HIbaby:是的 blence大說得我也遇過 甚至很多位置都有差異性 10/20 16:11
推 HIbaby:不過可能是生物品系不同所影響的 還是得檢討才行. 10/20 16:12
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作者: U0 (幽靈歡茄) 看板: Biotech
標題: Re: [方法] 如何對plasmid做site-directed mutation ?
時間: Sat Oct 20 18:42:41 2007
同病相憐
也曾被類似的問題給阻礙
那時候有看到一方法
可是自己還沒實際做過
因為後來重抽RNA多送幾個clone後問題就解決了
希望對大家有幫助
http://nar.oxfordjournals.org/cgi/content/full/32/21/e174
再打算做之前
我有先問過作者
他建議初學者可以將一管(4條primer mix)分兩管(2條2條)
然後用phusion這支做
用在deletion或短片段的insertion想必也是很好用的
參考參考
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◆ From: 140.109.50.83
推 chvkimo:想請問分兩管 是?? 不太懂耶 10/20 19:35
推 U0:product1跟product2分兩管做，做完再mix... 10/20 21:38
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作者: lentivirus () 看板: Biotech
標題: Re: [方法] 如何對plasmid做site-directed mutation ?
時間: Sat Oct 20 21:42:58 2007
其實做site direct mutagenesis方法還蠻多種的，
這個方法還不錯用
1 3
(RE1)----> ---->
RE1------------------X------------------RE2
<---- <----(RE2)
2 4
A: (RE1------------------X---)
B: (---X-------------------RE2)
C: (RE1------------------X-------------------RE2)
1st PCR: 分別做 primer 1 及 primer 2, primer 3 及 primer 4
得product A 及 product B (template source: target plasmid)
要將product cut and purify
2st PCR: 分別做 primer 1 及 primer 4
得 product A、B、C (template source: product of 1st PCR (1:1)
取product C--->purify, cut by RE1 and RE2
將target plasmid for SDR, cut RE1 and RE2 (取長段，短段為置換)
Ligation---transformation--->colony identification by sequencing
Note：RE1-------RE2的長度當然愈短愈好，一般大概三到五百bp
RE1及RE2最好是unique site (避免cut vector)
primer 2,3 design部分最好要變的點在中間，前後各延長10~15bp
GC結尾，specificity較高
以上我常用的方法，另外還可以用PCR的方法跑一整圈plasmid，
然後用Dpn1 cut 再接，實驗室有人做，應該是ok
有需要再提供給大家好了...我也沒實際試過 ^^""
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◆ From: 61.217.31.60
推 rickson:有錢的話直接去買mutagenesis kit，然後primer不需要純化 10/20 22:01
→ rickson:多挑幾個就好了 10/20 22:02
推 blence:何必買kit,以一般不易突變的pfu做PCR的reagent拿來用就ok了 10/20 22:18
推 liuse:我也都是用樓上說的 pfu 做完記得定全長確定其他沒錯 10/20 23:39
推 aggaci:好麻煩 直接quick change不就好了 10/22 03:16
推 HUVEC:我也是用quick change，不過貴一些就是了 10/23 14:27