[求救] site-directed mutagenesis

作者nhxcyge (人生就像個不可逆反應)

看板Biotech

標題[求救] site-directed mutagenesis

時間Fri Nov 11 20:28:31 2011

我現在是做A基因的點突變，用的方法是利用complement primer 25bp，而突變設計在中間利用這組primer做完pcDNA3-A一整圈plasmid，大小約6.7kb 目前卡在PCR出來的產物很少很少，以致於做transform後都沒有colony長出來… 曾想過把多管PCR產物跑膠(先以DpnI digest)後，把少量的產物集中一起elution 但濃度還是很低(1.1 ng/ul)。另外因此突變點位在基因末端(離stop codon約30bp,全長約1.4kb)，所以用下述方法心想應該行不通 F1----------> F2---------> ------------------------------------------------------ |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ------------------------------------------------------ R1<--------- R2<---------- 二段PCR產物overlap處為mutation site，不過會變成F1、R1夾出來1300多bp而F2、R2 夾出來可能100bp不到的產物，再將二個大小差距那麼大的產物加在一起覺得不太可行。所以想請問版上有人遇過這種狀況嗎？ Primer重新order過了，Tm值60.XX，PCR用Phusion polymerase。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.114.202.163

推 icome:跑膠再純會loss非常多我都直接transform很少失敗 11/11 20:40

→ icome:成功率跟enzyme和competent cll品質有很大關係 11/11 20:42

推 anchi35:有做過1.3Kb+200bp的也是類似的情形所以用vector的序列 11/11 20:48

→ anchi35:來做PCR 之後再重新接回 11/11 20:50

anchi35大，你是說把primer設計到vector中，離A基因的3'end有一段距離也可以囉？

→ blence:只要reaction及DpnI切完後,跑膠看得到隱約的band就會成功 11/11 20:51

→ blence:不須要purify或concentrate,因此5~10ul reaction是夠用的 11/11 20:55

blence大，你說的我做過，不過沒成功QQ 還是要多做幾次transform看能不能賽到一次XD ※ 編輯: nhxcyge 來自: 140.114.202.163 (11/11 21:24)

推 dodomilk:你是嫩嫩...？ 11/11 22:55

> -------------------------------------------------------------------------- < 作者: tutj (人生若只初相見) 看板: Biotech 標題: Re: [求救] site-directed mutagenesis 時間: Sat Nov 12 14:45:20 2011 ※ 引述《nhxcyge (人生就像個不可逆反應)》之銘言： : 我現在是做A基因的點突變， : 用的方法是利用complement primer 25bp，而突變設計在中間 complement primer應該是stratagene QuikChange的方法吧？ : 利用這組primer做完pcDNA3-A一整圈plasmid，大小約6.7kb : 目前卡在PCR出來的產物很少很少，以致於做transform後都沒有colony長出來… : 曾想過把多管PCR產物跑膠(先以DpnI digest)後，把少量的產物集中一起elution : 但濃度還是很低(1.1 ng/ul)。 : 另外因此突變點位在基因末端(離stop codon約30bp,全長約1.4kb)，所以用下述方法 : 心想應該行不通 : F1----------> F2---------> : ------------------------------------------------------ : |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| : ------------------------------------------------------ : R1<--------- : R2<---------- : 二段PCR產物overlap處為mutation site，不過會變成F1、R1夾出來1300多bp而F2、R2 : 夾出來可能100bp不到的產物，再將二個大小差距那麼大的產物加在一起覺得不太可行。 : 所以想請問版上有人遇過這種狀況嗎？ : Primer重新order過了，Tm值60.XX，PCR用Phusion polymerase。你的Tm值是照說明書的公式算的嗎？我有找到一個網站可以幫忙算 http://depts.washington.edu/bakerpg/primertemp/primertemp.html 如果你是照公式算, 說明書要求至少要78℃以上; 如果不是, 那Tm值一定太低這方法Tm值一定要夠高。因為primer完全complement, 還有突變的base 所以primer間的Tm值會比primer對DNA template的Tm值高如果一開始設計的Tm不夠高 PCR時primer會傾向形成primer dimer而不是黏上DNA template 至於你說的PCR產量低, 我之前有找到一篇paper 裡面說QuikChange有幾個缺點。一是上面提的易形成primer dimer 二是不能同時多點突變; 三就是PCR產量低。因為PCR從primer順著plasmid跑完一圈後頭尾接不起來形成nick 一對primer又是完全complement 整個PCR program只有parental plasmid可以做為DNA template 那篇paper發明了一種新方法 F1 ---------m-----------> ------------------*----------------------------------- *: nick |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| m: mutation -----------------------------------*------------------ R1<-----------------m------ 如圖, primer間只有部份overlap, mutation site在overlap region中間 3'延伸出去的部份蓋過PCR產物的nick 所以新生成帶有mutation的DNA可以當成template進刪PCR reaction 故一開始需要加入的DNA template可以降低, 提高之後挑mutant colony的機率 paper現在不在手邊, 如果你有興趣等星期一去實驗室我可以提供根據我整理的protocol 這邊primer跟template之間的Tm值稱為Tm no, primer-primer間的Tm稱為Tm pp 設計primer時Tm no要比Tm pp高5~10℃ PCR reaction的配方: 1x PCR reaction buffer, 1 uM primer pair, 2~10 ng DNA template (我用5 ng), 0.2 mM each dNTP (我怕不夠加到0.4 mM) 3u Pfu polymerase (其他DNA polymerase應該也可以), 補水到50 ul PCR program: 1. 95℃ 5 min x1 cycle 2. 95℃ 1 min (cycle數我照QuikChange的建議, 換掉a.a.跑16 cycles) Tm no-5℃ 1 min 72℃ 1 kp/2 min 3. 95℃ 1 min x1 cycle Tm pp-5℃ 1 min 72℃ 30min (據說此cycle能增加完整plasmid的生成率) elongation因為我用PfuUlatr II, 所以減到1 kb/min, 跑68℃ 然後primer因為高GC% Tm值超高,減五度也超過65℃ 所以annealing照QuikChange跑55℃ 最後一個cycle省略成只跑72℃ 30min 取10 ul PCR product跑膠有超亮的single band 提供給你參考~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 175.181.106.80

→ tutj:An efficient one-step site-directed deletion, insertion, 11/12 15:15

→ tutj:single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol 11/12 15:16

→ tutj:BMC Biotechnology 2008, 8:91 11/12 15:16

推 dodomilk:推新方法，不過我覺得原本的方法就很好用了... 11/12 16:49

→ dodomilk:每次作都能挑到十幾個colonies 11/12 16:50

推 ooooh:這篇超專業 11/12 22:55

推 nhxcyge:推! 我原本的primer再出不來就用你這方法試試 11/14 11:55

> -------------------------------------------------------------------------- < 作者: blence ( ) 站內: Biotech 標題: Re: [求救] site-directed mutagenesis 時間: Sun Nov 13 00:23:39 2011 補充一下 QuickChange是可以同時做多點突變，甚至做1kb以上大片段deletion的不過我同意將原本protocol改成用partial complement primer效率會更好只不過我的經驗是primer至少要有18~20bp以上的complement 幾次complement太短(嘗試<15bp)反而都失敗因此如果只是1~2bp的mutation，primer大概25bp都ok 也就是 (3bp)( 20bp )(3bp) Forward: -----M------------> Reverse: <---------M-------- primer太長，Tm就會偏高，短一點的話，GC高的部分會比較好做如果再搭配plasmid 50ng 對於1~2bp極短片段的突變幾乎用55度萬用Tm應該不成問題 : PCR時primer會傾向形成primer dimer而不是黏上DNA template : 至於你說的PCR產量低, 我之前有找到一篇paper : 裡面說QuikChange有幾個缺點。一是上面提的易形成primer dimer : 二是不能同時多點突變; 三就是PCR產量低。 : 因為PCR從primer順著plasmid跑完一圈後頭尾接不起來形成nick : 一對primer又是完全complement : 整個PCR program只有parental plasmid可以做為DNA template : 那篇paper發明了一種新方法 : F1 ---------m-----------> : ------------------*----------------------------------- *: nick : |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| m: mutation : -----------------------------------*------------------ : R1<-----------------m------ : 如圖, primer間只有部份overlap, mutation site在overlap region中間 : 3'延伸出去的部份蓋過PCR產物的nick : 所以新生成帶有mutation的DNA可以當成template進刪PCR reaction 我想新生成的含m的DNA應該是不能當成template的否則最後的產物會是一堆兩端都含有m的blunt end product （primer已經有m了，新生成的也有m）也就是 (F1 primer) ( R1 novel synthesis ) -----m-----------------------------------m----> 以及 ( F1 novel synthesis ) (R1 primer) <-----m-----------------------------------m---- : 故一開始需要加入的DNA template可以降低, 提高之後挑mutant colony的機率 : paper現在不在手邊, 如果你有興趣等星期一去實驗室我可以提供 : 根據我整理的protocol : 這邊primer跟template之間的Tm值稱為Tm no, primer-primer間的Tm稱為Tm pp : 設計primer時Tm no要比Tm pp高5~10℃ : PCR reaction的配方: 1x PCR reaction buffer, 1 uM primer pair, : 2~10 ng DNA template (我用5 ng), 0.2 mM each dNTP (我怕不夠加到0.4 mM) : 3u Pfu polymerase (其他DNA polymerase應該也可以), 補水到50 ul : PCR program: : 1. 95℃ 5 min x1 cycle : 2. 95℃ 1 min (cycle數我照QuikChange的建議, 換掉a.a.跑16 cycles) : Tm no-5℃ 1 min : 72℃ 1 kp/2 min : 3. 95℃ 1 min x1 cycle : Tm pp-5℃ 1 min : 72℃ 30min (據說此cycle能增加完整plasmid的生成率) : elongation因為我用PfuUlatr II, 所以減到1 kb/min, 跑68℃ : 然後primer因為高GC% Tm值超高,減五度也超過65℃ : 所以annealing照QuikChange跑55℃ 最後一個cycle省略成只跑72℃ 30min : 取10 ul PCR product跑膠有超亮的single band : 提供給你參考~ 我認識的大多跑10~25ul reaction 因此都是用3~5ul check 另外一些method paper提過extension 68度會比72度有降低突變的機率不過缺點是amphify效率差 product不用多，一般EtBr的limitation約10ng左右只要ErBr看得到，那失敗的探討就可能不是QuickChange的過程 ※ 編輯: blence 來自: 140.109.40.29 (11/13 17:00) > -------------------------------------------------------------------------- < 作者: aggaci (台南工作的基隆人) 看板: Biotech 標題: Re: [求救] site-directed mutagenesis 時間: Wed Nov 16 18:11:23 2011 ※ 引述《aggaci (台南工作的基隆人)》之銘言： ※ 引述《nhxcyge (人生就像個不可逆反應)》之銘言： : 我現在是做A基因的點突變， : 用的方法是利用complement primer 25bp，而突變設計在中間 : 利用這組primer做完pcDNA3-A一整圈plasmid，大小約6.7kb : 目前卡在PCR出來的產物很少很少，以致於做transform後都沒有colony長出來… : 曾想過把多管PCR產物跑膠(先以DpnI digest)後，把少量的產物集中一起elution : 但濃度還是很低(1.1 ng/ul)。 : 另外因此突變點位在基因末端(離stop codon約30bp,全長約1.4kb)，所以用下述方法 : 心想應該行不通 : F1----------> F2---------> : ------------------------------------------------------ : |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| : ------------------------------------------------------ : R1<--------- : R2<---------- : 二段PCR產物overlap處為mutation site，不過會變成F1、R1夾出來1300多bp而F2、R2 : 夾出來可能100bp不到的產物，再將二個大小差距那麼大的產物加在一起覺得不太可行。 : 所以想請問版上有人遇過這種狀況嗎？ : Primer重新order過了，Tm值60.XX，PCR用Phusion polymerase。我的方法不一樣提供給大家我的是 P---------m-----------> ------------------------------------------------------ m:mutation |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ------------------------------------------------------ <---------------P 這樣做PCR 因為沒重疊所以不太會形成primer dimer 會比較好做要注意的地方在於我的primer尾端會加phosphate 因為這樣做出來是linear DNA所以之後拿去作ligation...... 效率不錯!!我覺得比傳統quickchange好做很多另外我用的是fynzyme的phusion pfu 這pfu超好用作的超準超快超多 -- 單身不代表寂寞，寂寞是走在一個不愛妳的人身邊的時候。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.116.253.121 ※ 編輯: aggaci 來自: 140.116.253.121 (11/15 23:41) ※ 編輯: aggaci 來自: 140.116.253.121 (11/15 23:42) ※ 編輯: aggaci 來自: 140.116.253.121 (11/15 23:43)

推 Ianthegood:推phusion 超貴超好用 11/16 00:35

→ dodomilk:這方法聽起來不錯！照你這樣講的話，primer不事先加P應 11/16 01:01

→ dodomilk:該也是可以的，只是之後要多一道PNK的步驟 11/16 01:01

→ aggaci:對阿要多磷酸化這一步 11/16 01:11

推 micocat:有重疊的好處是不用ligation,pcr完就可以transform了 11/16 01:34

→ micocat:不重疊的話就是blunt end ligation囉 11/16 01:35

推 mattmatt:phusion+1 上面+1..不用ligation省事很多 11/16 10:14

推 dodomilk:blunt end self ligation超好作的，不可能會失敗... 11/16 11:30

→ aggaci:真的但不管怎樣肯定比TWO-STEP pcr好做很多 11/16 11:52

推 silverberry:想請問樓上們，把 plasmid 做一圈出來的方法， 11/16 15:01

→ silverberry:要怎麼確定沒有不小心錯在 plasmid 上? 11/16 15:01

→ silverberry:我們實驗室都很怕死的做 2 step PCR 11/16 15:02

→ silverberry:雖然速度沒有慢很多，但是還是很多步驟。 11/16 15:02

簡單阿我們lab的做法是 insert 沒錯就好之後把insert 切下來再接到新的vector上 2 step pcr難用又難做

→ silverberry: 請大家給點建議~~~ 謝謝^^ 11/16 15:03

推 dodomilk:用pfu 11/16 17:30

PFU還是無法保証vector sequence有沒出錯除非你去對整個vector定序所以最安全的做法是把insert 切下來再接到新的vector上 -- 單身不代表寂寞，寂寞是走在一個不愛妳的人身邊的時候。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.116.253.121 ※ 編輯: aggaci 來自: 140.116.253.121 (11/16 18:12)

→ lovesteve:我的作法是PCR產物處理DpnI後產物+PNK+Ligase 在16度2h 11/16 19:12

→ lovesteve:效果也不錯! 11/16 19:13

> -------------------------------------------------------------------------- < 作者: aggaci (台南工作的基隆人) 看板: Biotech 標題: Re: [求救] site-directed mutagenesis 時間: Tue Nov 15 23:41:15 2011 ※ 引述《nhxcyge (人生就像個不可逆反應)》之銘言： : 我現在是做A基因的點突變， : 用的方法是利用complement primer 25bp，而突變設計在中間 : 利用這組primer做完pcDNA3-A一整圈plasmid，大小約6.7kb : 目前卡在PCR出來的產物很少很少，以致於做transform後都沒有colony長出來… : 曾想過把多管PCR產物跑膠(先以DpnI digest)後，把少量的產物集中一起elution : 但濃度還是很低(1.1 ng/ul)。 : 另外因此突變點位在基因末端(離stop codon約30bp,全長約1.4kb)，所以用下述方法 : 心想應該行不通 : F1----------> F2---------> : ------------------------------------------------------ : |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| : ------------------------------------------------------ : R1<--------- : R2<---------- : 二段PCR產物overlap處為mutation site，不過會變成F1、R1夾出來1300多bp而F2、R2 : 夾出來可能100bp不到的產物，再將二個大小差距那麼大的產物加在一起覺得不太可行。 : 所以想請問版上有人遇過這種狀況嗎？ : Primer重新order過了，Tm值60.XX，PCR用Phusion polymerase。我的方法不一樣提供給大家我的是 P---------m-----------> ------------------------------------------------------ m:mutation |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ------------------------------------------------------ <---------------P 這樣做PCR 因為沒重疊所以不太會形成primer dimer 會比較好做要注意的地方在於我的primer尾端會加phosphate 因為這樣做出來是linear DNA所以之後拿去作ligation...... 效率不錯!!我覺得比傳統quickchange好做很多另外我用的是fynzyme的phusion pfu 這pfu超好用作的超準超快超多 -- 單身不代表寂寞，寂寞是走在一個不愛妳的人身邊的時候。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.116.253.121 ※ 編輯: aggaci 來自: 140.116.253.121 (11/15 23:41) ※ 編輯: aggaci 來自: 140.116.253.121 (11/15 23:42) ※ 編輯: aggaci 來自: 140.116.253.121 (11/15 23:43)