[問題] 有關於抽質體DNA的問題

[hchs890843 (紫魚)]

我現在在實驗室打工，然後會常常碰到要幫學長姐抽質體DNA的工作

一般的菌還好，可是每次我遇到一種叫VSVG的質體就完了

產率相當的低，每次可能都要多弄好幾罐才能抽夠

我現在是在作大量質體的製備，利用廠商設計好的工具說明來抽。



現在就我所學的，想到的只有一些原因
本身質體就很不容易被transformation到大腸桿菌裡，因為比較大

本身VSVG的copy number數低(這是實驗室的學長姐跟我說的)


想找尋一些對付這種low copy的質體DNA，我把一些學長姐提供的意見與自己的愚笨
想法一起貼上來，希望大家能給點意見討論討論>"<

學長姐的建議：

‧多養一些菌，在lysis buffer裡面放比較久一點
‧盡可能的小心....
‧如果覺得很煩那就retransformation囉！因為可能當時的competent cell不夠好
‧抽dna加isopropanol後，丟到-80 o/n，第二天再去抽


我的一些想法：
‧把菌養久一點，例如說我今天養500ml的菌，10小時後去抽。那我把養的時間加長
變成18或24小時之後再去抽，會不會比較好？或會更糟？
通常大家對這些細菌大約都養多久，或去測OD600時大約在多少左右是一個可能得到
較多的量？

我其實很擔心這樣菌會不會活太老然後就像做competent cell一樣 失敗

‧不用過column的技術，用傳統的酒精沉澱法去做，據說這樣可能盡可能的減低DNA黏
在column上的機會。不過這個傳統技術有什麼先天限制嗎？

‧用更高的轉速轉DNA：這有用嗎？我是以抽病毒的方法去想的，想把病毒弄下來就是
要轉快一點...


我觀察一些菌的生長情形，像我們養的VSVG跟其他比較high copy的菌，總覺得它雖
然用同樣的時間去養，可是就是感覺混濁度就比其他的菌低一些，有時還覺得它好像都
沒長一樣，跟昨天放下去的LB顏色差不多XD


↑有時候上面的天馬行空版思考學長姐都覺得不太可能，可是...還是來問一下


大概就是這樣了....板上的前輩謝謝你們看文章

如果前輩覺得這些資訊是可以自修被查到的
那可否提供大概的方向，要往哪裡去找會比較好
我想我可以去看看，然後再把不懂的東西提出

總之謝謝各位

--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 203.71.87.1
※ 編輯: hchs890843      來自: 203.71.87.1          (04/12 23:57)
※ 編輯: hchs890843      來自: 203.71.87.1          (04/13 01:04)
推 Chester:給你一個M!nice發問文:))))
→ apa9394:推 先三思而後問之...
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作者: Highwind (小羊回來了) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 有關於抽質體DNA的問題
時間: Wed Apr 13 00:25:33 2005

※ 引述《hchs890843 (紫魚)》之銘言：
: 大概就是這樣了....板上的前輩謝謝你們看文章
: 如果前輩覺得這些資訊是可以自修被查到的
: 那可否提供大概的方向，要往哪裡去找會比較好
: 我想我可以去看看，然後再把不懂的東西提出
: 總之謝謝各位
這本手冊可以看一下
http://0rz.net/210gS
尤其在第67頁
不外兩個方向
1.增加抽取的效率,lysis buffer多一點,沉澱久一點
把columm的capacity填滿就對了
2.要拼菌量就用TB

時間大概十幾個小時就夠了
如果還搖不起來,就是失敗

--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 219.68.85.208
※ 編輯: Highwind        來自: 219.68.85.208        (04/13 00:27)
推 hchs890843:謝謝學長
→ hchs890843:事實上我也有那本手冊...只是不知從何讀
推 Liat:我也沒抽過這個質體，但之前有將很難抽夠量的質體換
→ Liat:host之後，質體量成功提升的經驗，你或許可試試此法
→ Liat:另外要注意，Q牌最強調的就是菌量不要過高，會破壞
→ Liat:column的binding能力，反而只是浪費時間養菌
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作者: noodle (noodle) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 有關於抽質體DNA的問題
時間: Thu Apr 21 17:17:37 2005

※ 引述《Highwind (小羊回來了)》之銘言：
: ※ 引述《hchs890843 (紫魚)》之銘言：
: : 大概就是這樣了....板上的前輩謝謝你們看文章
: : 如果前輩覺得這些資訊是可以自修被查到的
: : 那可否提供大概的方向，要往哪裡去找會比較好
: : 我想我可以去看看，然後再把不懂的東西提出
: : 總之謝謝各位
: 這本手冊可以看一下
: http://0rz.net/210gS
: 尤其在第67頁
: 不外兩個方向
: 1.增加抽取的效率,lysis buffer多一點,沉澱久一點
: 把columm的capacity填滿就對了
: 2.要拼菌量就用TB
: 時間大概十幾個小時就夠了
: 如果還搖不起來,就是失敗


 請多加一倍的antibiotics去養, 千萬不要想養久一點~~這樣產率會下降~~

 就是如果你的antibiotics原本加的是100 ug/ml, 就加個200 ug/ml, 這樣就OK了～

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  總是在快樂的時候,感到微微的惶恐.

  在開懷大笑時,留下感動的淚水.

  我無法相信單純的幸福.

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