作者lsalber (...)
看板Biotech
標題[問題] 關於large plasmid送進E.coli實驗方法...
時間Wed Nov 17 23:05:16 2004
目前想要將一個大約 10kb 的plasmid送入DH5 alpha的菌株當中
採用的transformation流程如下:
1.加入100ng的ligation產物(i:v=3:1)
2.冰上 30min
3.42度 45s
4.冰上 2min
5.加入LB 1ml, 37度 45min
6.塗盤
可是似乎沒有用,已經確定小分子量的plasmid（~6kb）用此方法可以見效
想請問是否有其他改良方法可以解決大分子量plasmid送不進去E.coli的問題
難道唯有用electroporation或是買commercial的competent cell了嗎?
謝謝您的指教:)
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.114.98.132
> --------------------------------------------------------------------------- <
作者 blence ( ) 看板 Biotech
標題 Re: [問題] 關於large plasmid送進E.coli實驗方法...
時間 Thu Nov 18 00:36:05 2004
───────────────────────────────────────
※ 引述《lsalber (...)》之銘言：
: 目前想要將一個大約 10kb 的plasmid送入DH5 alpha的菌株當中
: 採用的transformation流程如下:
: 1.加入100ng的ligation產物(i:v=3:1)
: 2.冰上 30min
: 3.42度 45s
: 4.冰上 2min
: 5.加入LB 1ml, 37度 45min
: 6.塗盤
: 可是似乎沒有用,已經確定小分子量的plasmid（~6kb）用此方法可以見效
: 想請問是否有其他改良方法可以解決大分子量plasmid送不進去E.coli的問題
: 難道唯有用electroporation或是買commercial的competent cell了嗎?
: 謝謝您的指教:)
我覺得你可以修正insert:vector的值
改為mole數3:1或3以上比較適當
: 5.加入LB 1ml, 37度 45min
: 6.塗盤
: 可是似乎沒有用,已經確定小分子量的plasmid（~6kb）用此方法可以見效
: 想請問是否有其他改良方法可以解決大分子量plasmid送不進去E.coli的問題
: 難道唯有用electroporation或是買commercial的competent cell了嗎?
: 謝謝您的指教:)
我覺得你可以修正insert:vector的值
改為mole數3:1或3以上比較適當
說到大size的plasmid
我上一次的經驗是，5.8k insert的11k的plasmid
ligation的部分是以DH10b electroporation成功的
而circular plasmid只要像你那樣的步驟就可以了
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 61.31.146.207
推 lsalber:我想應該問題不是在ligation上 140.114.223.124 11/18
→ lsalber:不過還是會確認看看,看來試試看用電的好了 140.114.223.124 11/18
→ lsalber:謝謝囉^^ 140.114.223.124 11/18
> --------------------------------------------------------------------------- <
作者 HIbaby (嗨北鼻) 看板 Biotech
標題 Re: [問題] 關於large plasmid送進E.coli實驗方法...
時間 Thu Nov 18 08:02:38 2004
───────────────────────────────────────
試一下759篇
我們實驗室有跟你差不多大小的質體
他是用一般方法轉進去的
你試試看
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 219.1.156.27
→ HIbaby:高效率competent cell 製作 219.1.156.27 11/18
→ HIbaby:剛問一下那個人 他前一陣子成功送入37kb 219.1.156.27 11/18