[問題] 關於yeast transformation的問題

[lsalber (...)]

最近在yeast transformation遭遇到問題= =a

以下是我的PROTOCOL:

1. single colony in 3ml YPD, o/n, OD600=2

2. transfer 1ml into 20ml YPD, 3-4hr, OD600=0.4-0.6

3. cfg, 1ml ddH2O wash, 0.5ml LoAc wash

4. resuspend yeast in 100uL 1mM LiAc

5. add 100ng plasmid and 0.1mg carrier DNA, vortex

6. 600uL 40%PEG/100uMLiAc mixture, vortex

7. 30度, 30min, shaking at 200rpm

8. add 70uL DMSO, no vortex

9. 42度, 15min

10. on ice, 1-2min

11. cfg, discard supernatent

12. add 100uL ddH2O, on sc plate(trp-)

13. incubation at 30度

使用的菌株是AB-DE1

結果以此方法處理完之後將plate放置了 5 天

negative control (w/o plasmid)都沒有菌落的情況

而實驗組似乎有colony的形成,數量也不少,可是菌落的的規模卻十分低小

直徑不到0.01mm(看得到小點點而已= =a?)

這樣的狀況是正常的嗎?

曾經聽說 SC plate 需要避光,不然會降低plating effeciency,是真的嗎?

究竟是在配置的什麼時候開始避光呢?以及是何成分需要避光?

以下是我的 SC plate 的成分
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yeast nitrogen base 1.7/L
ammonium sulfate     5g/L
casamino acids       5g/L
agar                20g/L
--------------------------
autoclave 30min

add:
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glucose            20mg/L
adenine            30mg/L
Histidine          20mg/L
arginine           30mg/L
Leucine            40mg/L
Lysine             40mg/L

先謝謝您這麼有耐心地看完這篇文章:)


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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 140.114.98.132
→ lsalber:補充一下...我有看到colony有在長大,很慢
推 oplz:你列的成分裡面沒有要避光的分子..應該是
→ oplz:不用避光吧...另外你要看你的 positive 是
→ oplz:不是長得很正常..如果P/C正常的話, 那些
→ oplz:只長出一點點又長不大的 colonies 就是
→ oplz:extremely weak interaction 的 clones 了
→ oplz:很有可能是 false positive..
推 lsalber:我只是想要把單一蛋白質送入以便ꐠ
→ lsalber:後續的純化，並非YEAST TWO-HYBRID
→ oplz:I see..sorry 誤解了你的實驗..again..我
→ oplz:覺得 plate 不用避光, 如果單純的
→ oplz:transformatin 五天還沒長大..那很可能有
→ oplz:問題..yeast 不該長這麼慢..除非其中有幾
→ oplz:個 selection marker 或成分有問題...
推 lsalber:恩...看來我得回去好好檢查一下:)