推 littlesky:直接 clean up, 不跑電泳.可增加回收率 203.204.140.176 12/06
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作者 wensing (煉金術：等價交換) 看板 Biotech
標題 Re: [問題] 請問切DNA片段
時間 Sun Dec 5 20:29:19 2004
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: 雖然說純化會有漏失..但是有這麼嚴重嗎?
: 還是說可以就不純化?
: 或是各位高手有建議的的方法嗎?
第一步驟，若酵素過量、長時間下不會發生亂切時，
我建議你酵素用過量 (1ugDNA用3~4ulenzyme)，確保"絕對"切下
因為酵素放久或使用不當時，有時其活性會降低，造成切不乾淨。
然後加熱使enzyme失活(需要的話，必做)，再來是純化(我們是用"gel extraction kit")。
第二步驟，與上述相同。
其他細節注意事項，請看讀廠商附的protocol。
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◆ From: 203.73.254.22
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作者 yusi (Science魔人合~體) 看板 Biotech
標題 Re: [問題] 請問切DNA片段
時間 Sun Dec 5 21:58:03 2004
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: 第二步驟，與上述相同。
: 其他細節注意事項，請看讀廠商附的protocol。
======>引用幽戲的銘言
應該也可以在利用稀釋的方法來切 二個enzyme
例如
：第一個enzyme在10 ul的體積切 第二個enzyme dilute 到50 ul體積切
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◆ From: 218.166.72.63
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作者 YuChHa (讓自己更勇敢) 看板 Biotech
標題 Re: [問題] 請問切DNA片段
時間 Sun Dec 5 22:26:02 2004
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看不到band不一定是沒有DNA
你還是可以做個ligation
只要步驟都沒錯
再去做個transformation
通常是都會有成功的
加油!!^^
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◆ From: 218.161.113.44
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作者 aokman (不完美的完美) 看板 Biotech
標題 Re: [問題] 請問切DNA片段
時間 Sun Dec 5 23:14:22 2004
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: 看不到band不一定是沒有DNA
: 你還是可以做個ligation
: 只要步驟都沒錯
: 再去做個transformation
: 通常是都會有成功的
: 加油!!^^
那看不到時.跑回收膠
是不是就是往約0.5k的位子切下來回收?
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◆ From: 218.162.102.51
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作者 wensing (煉金術：等價交換) 看板 Biotech
標題 Re: [問題] 請問切DNA片段
時間 Sun Dec 5 23:23:04 2004
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※ 引述《aokman (不完美的完美)》之銘言：
: : 看不到band不一定是沒有DNA
: : 你還是可以做個ligation
: : 只要步驟都沒錯
: : 再去做個transformation
: : 通常是都會有成功的
: : 加油!!^^
: 那看不到時.跑回收膠
: 是不是就是往約0.5k的位子切下來回收?
這不太好，若位子偏一點，可能切下只有一半，或全都沒有！
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◆ From: 203.73.254.22
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作者 HIbaby (嗨北鼻) 看板 Biotech
標題 Re: [問題] 請問切DNA片段
時間 Mon Dec 6 11:18:27 2004
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※ 引述《aokman (不完美的完美)》之銘言：
: 我正在做專題~但是遇到問題Q_Q
: 有段DNA片段(0.5k)
: 需要用Nde1和Sal1來切
查了一下Takara的限制酵素表，發現這兩個都可以用 H buffer (EcoR I同）可以切阿
另外，你的片段是從質體上切下來的嗎?
還是pcr產物?
若是pcr產物，如果你限制脢周圍沒有多一兩個base可能會切不動。
如果是我
我會以質體約 3-5ug 用H buffer 切兩個小時 救用膠體回收
回收後通常kit（管柱回收型）建議用50-100uL回收，我會用300uL水做最後一步。
最後在酒精沈澱等。
ps. 如果你不知道H buffer 那可以用EcoR I的buffer當共同buffer
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◆ From: 219.1.156.27
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作者 aokman (不完美的完美) 看板 Biotech
標題 Re: [問題] 請問切DNA片段
時間 Mon Dec 6 18:52:52 2004
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: 查了一下Takara的限制酵素表，發現這兩個都可以用 H buffer (EcoR I同）可以切阿
: 另外，你的片段是從質體上切下來的嗎?
: 還是pcr產物?
: 若是pcr產物，如果你限制脢周圍沒有多一兩個base可能會切不動。
: 如果是我
: 我會以質體約 3-5ug 用H buffer 切兩個小時 救用膠體回收
: 回收後通常kit（管柱回收型）建議用50-100uL回收，我會用300uL水做最後一步。
: 最後在酒精沈澱等。
: ps. 如果你不知道H buffer 那可以用EcoR I的buffer當共同buffer
我這邊用的enzyme buffer是Biolab出的
EcoR 1他所專用的buffer是Udd ＠＠
配方都差不多嗎？？
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◆ From: 140.120.208.34
推 blence:這....... 61.31.134.182 12/06
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作者 gilchang.bbs@bbs.wretch.cc (也是老外), 看板 Biotech
標題 Re: [問題] 請問切DNA片段
時間 無名小站 (Mon Dec 13 21:39:55 2004)
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> 還是說可以就不純化?
> 或是各位高手有建議的的方法嗎?
1. 你確定你第一個enzyme有切動嗎?
你應該先拿出個0.5或1.0 microlitter去check一下
2. 你的reaction solution當中DNA 有30 microlitter,
我想問的是那DNA 是用什麼溶的(應該不是TE buffer吧)?
從哪兒來的(plasmid or PCR)?
重要的是裡面DNA 的量到底有多少microgram?
3. 如果是plasmid DNA, 我不建議切overnight.
而且, 你的reaction volume才50 microlitter,
你切個幾小時(1 小時以上), 他的體積會因為水凝在蓋子上就變很多.
如果要切overnight, 我建議體積弄到100 microlitter比較好.
4. 上頭有人說了, 可以在第二個enzyme切時加大你反應體積.
這時我會建議先用Sal I 再用Nde I.
5. 如果要分開切, 一定要先純化.
其他意見如上頭的人說過的....
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