[問題] 請問限制脢digest的時間

去年我在美國的實驗室作

印象中(很抱歉我真的是憑印象,所以可能有錯)

都是一小時左右

最多到兩小時

方法是水浴

這個暑假在中研院

聽說digest動不動就跑overnight...ex:BamHI

最少好像是兩小時...ex:EcoRI

我還蠻震驚的

都是用NEB的產品

請問是我記錯

還是在中研院這邊比較實在...一定要切乾淨

對我來說切到90%跟99%實在沒有太大的不同

我倒是很懶得等實驗

謝謝各位!
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※ Origin: 生命科學 BBS <bbs.life.nthu.edu.tw> 
◆ From: gw.PENG.idv.tw
推 btnsdolphin:之前做過也是一到兩小時間耶 切太久不是會
→ btnsdolphin:亂切嗎@@
推 YuChHa:Star Activity 要看 enzyme
→ YuChHa:EcoRI就很強  NotI就很弱  幾乎看不到
推 Liat:如果酵素保存或使用習慣很差，活性會掉很快，這時你
→ Liat:不切久一點的話，效果當然不佳 XD
推 feifeilin:老闆曾說過水乾不乾淨對於酵素作用也會有差別
→ feifeilin:（他的重點是美國LAB的水比我們LAB乾淨）
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發信人: [e-mail] (六百), 看板: Biotech
標  題: Re: [問題] 請問限制脢digest的時間
發信站: 清華生命科學 BBS (Mon Jul 11 23:17:44 2005)
轉信站: ptt!Group.NCTU!grouppost!Group.NCTU!nthuls

酵素的濃度跟時間 還有DNA的量都要考慮

原則上 多少酵素 多少時間可以切多少DNA 是可以計算出來的
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莫非定律:
    到了期末才會想起期初曾選了一門課卻一直沒去上
補充定律:
    拿到成績單才發現上了一學期的課忘了去考期末考
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※ Origin: 生命科學 BBS <bbs.life.nthu.edu.tw> 
◆ From: 210-85-213-142.cm.dynamic.apol.com.tw

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作者: YuChHa (山風冰凍我的心) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請問限制脢digest的時間
時間: Mon Jul 11 23:57:10 2005

※ 引述《[e-mail] (六百)》之銘言：
: 酵素的濃度跟時間 還有DNA的量都要考慮
: 原則上 多少酵素 多少時間可以切多少DNA 是可以計算出來的
體積很重要吧
你看NEB上面說 reaction volumn 是 50 uL
但是我在台灣老師都是叫我用 10 uL 而已
但是體積變小
Enzyme 都含有 glycerol (避免低溫高溫互換破壞酵素)
當你 glycerol 含量太高會抑制反應
我有試過用 50 uL
切一個小時候再去用 speedvac 減小體積
的確可以切的很乾淨
但是同樣的量的 DNA 和 enzyme 在 total volumn 是 10 uL 中
就切不太乾淨了!!

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最愛小嵐兒~~^_^~~

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 59.121.133.212

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發信人: [e-mail] (peach's leaving), 看板: Biotech
標  題: Re: [問題] 請問限制脢digest的時間
發信站: 不良牛牧場 (Tue Jul 12 03:21:38 2005)
轉信站: ptt!Group.NCTU!grouppost!Group.NCTU!SimFarm

※ 引述《[e-mail] (山風冰凍我的心)》之銘言：
: ※ 引述《[e-mail] (六百)》之銘言：
: : 酵素的濃度跟時間 還有DNA的量都要考慮
: : 原則上 多少酵素 多少時間可以切多少DNA 是可以計算出來的
: 體積很重要吧
: 你看NEB上面說 reaction volumn 是 50 uL
: 但是我在台灣老師都是叫我用 10 uL 而已
: 但是體積變小
: Enzyme 都含有 glycerol (避免低溫高溫互換破壞酵素)
: 當你 glycerol 含量太高會抑制反應
: 我有試過用 50 uL
: 切一個小時候再去用 speedvac 減小體積
: 的確可以切的很乾淨
: 但是同樣的量的 DNA 和 enzyme 在 total volumn 是 10 uL 中
: 就切不太乾淨了!!
可是一般做check大概也不用切這麼乾淨

而且一個mini tank電泳槽內的gel上well容量有限

假設抽3 ml E. coli內一個copy number 300左右的plasmid

我大概都會回溶30ul左右
(sorry...抽這種小量的DNA沒在定量的......XDDD)

然後取4 ul，total體積帶到10 ul(RE憑感覺，一般大概就下0.3 ul)

這樣切出來的mixture可以全部loading到well內.......

簡單來說，就是避免因為digestion體積太大所以DNA要下很多

畢竟只是check，剩下來的DNA說不定還有其他目的

我的經驗啦... 用Takara的NdeⅠ或NcoⅠ這種酵素活性只有300~400U的RE
(Takara建議的reaction volumn是25 ul)

按照上述條件，大概切個3~4hr就綽綽有餘

若是10000U的EcoRⅠ，大概1hr就夠了....

反正要搞到star activity還挺難就是  ^^"



好啦~ 我知道上面看起來我的實驗方式很粗糙  XDDDD
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推 YuChHa:我要是這樣做  我老闆應該不會讓我畢業吧!!^^"
推 oplz:大致上這樣子做都很 okay..只是如果你是用 column
→ oplz:抽 plasmid, 回溶到 30ul 可能不能得到全部的 DNA
→ oplz:再多加一點體積會比較好...可看一下 kit manual.印
→ oplz:象中是 35ul..我大概都用 50ul..濃度還是很高, 大概
→ oplz:250 ng/ul 左右..應該已到 column beads 的飽和量了
→ YuChHa:我有時候可以抽到450ng/uL  但很少有這樣的"運氣"
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作者: jazzdevil (Joyce) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請問限制脢digest的時間
時間: Wed Aug 17 18:27:19 2005

NEB跟TAKARA的酵素我都有在使用
嗯 看你要切多少DNA的量
一般在酵素使用上 一個UNIT切一個micro gram的DNA 做用於37度c一小時
不過通常我們都用2個unit去切一個micro gram的DNA 作用一小時(可以參
考買來時送的酵素介紹表,看你的酵素共含有幾個unit/micro liter)
但如果有些酵素切的效率不夠好的話 頂多多切十分鐘
BamHI跟EcoRI效率都挺好的.. 該不用切過久





※ 引述《[e-mail] (take your mark!)》之銘言：
: 去年我在美國的實驗室作
: 印象中(很抱歉我真的是憑印象,所以可能有錯)
: 都是一小時左右
: 最多到兩小時
: 方法是水浴
: 這個暑假在中研院
: 聽說digest動不動就跑overnight...ex:BamHI
: 最少好像是兩小時...ex:EcoRI
: 我還蠻震驚的
: 都是用NEB的產品
: 請問是我記錯
: 還是在中研院這邊比較實在...一定要切乾淨
: 對我來說切到90%跟99%實在沒有太大的不同
: 我倒是很懶得等實驗
: 謝謝各位!

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