推 wensing:可能會，要看看酵素的辨認碼是多長！ 59.104.120.177 09/09
推 alla:切下來的小片段 如果不看單股的只有一個bp 220.138.34.125 09/10
推 Liebesleid:會，小於 6bp 就要分開切。 210.58.172.4 09/10
推 alla:哪裡可以查到相關的資料如果一定要切那要怎麼分開切 61.216.167.92 09/11
推 lnyhn:翻NEB的附錄應該有資料吧 140.120.99.201 09/11
> -------------------------------------------------------------------------- <
作者: alla (只想開開心心過生活) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請問兩個cutting site很接近會影響cut的嗎
時間: Sun Sep 11 19:55:18 2005
※ 引述《alla (只想開開心心過生活)》之銘言：
: 我再做將insert插入vector的實驗
: 用兩個不同的enzyme去cut
: 用BamH1跟Xho1
: 兩個的cutting site很接近
: 我算過如果能切
: 切下來的小片段大概只有5bp
: 所以會因為如此影響嗎
: 請各位大大幫我解答一下
補充一下問題
Xho1 BamH1
/ /
ACTCGAGGATCCA
TGAGCTCCTAGGT
/ /
Xho1 BamH1
請問這樣有影響嗎
可以順便跟我說在哪裡可以找到資料
而如果只要cut這兩個site又怎麼做
如何分開切
謝謝囉
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 163.25.94.80
> -------------------------------------------------------------------------- <
作者: cutilis (...) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請問兩個cutting site很接近會影響cut的嗎
時間: Mon Sep 12 15:06:23 2005
: Xho1 BamH1
: / /
: ACTCGAGGATCCA
: TGAGCTCCTAGGT
: / /
: Xho1 BamHI
不可能會被這兩個酵素"同時"切動,
分開切應該是可以,因為XhoI辨認CTCGAG,切開之後剩下TCGAGGATCC
CCTAGG
所以還可以讓BamHI辨認,然後切割
所以應該是必須將DNA先用一種酵素切割後,然後clean up,
再用另一種酵素切割.
clean up方法看酵素能否用heat inactivate,然後用酒精沉澱DNA,
或是用KIT clean up DNA也可以.
有錯請指正.
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 61.230.139.227
推 Liebesleid:用 kit 就可以了。 140.112.78.45 09/12
推 ilee:請問~兩個一起切, 切久一點可以切的動嗎? 140.120.136.93 09/13
→ ilee:不能同時切動可以理解~因為酵素的立體障礙 140.120.136.93 09/13
推 ilee:ㄧ但第一刀切動後, 地二刀再接著切, 這樣可能嗎? 140.120.136.93 09/13
→ ilee:用kit clean up很方便, 單純想了解是否能ㄧ起切 140.120.136.93 09/13
→ ilee:謝謝各位的指教~ 140.120.136.93 09/13
推 Liebesleid:不可以 140.112.78.45 09/13
推 cutilis:一個切完之後害是會留在DNA上吧,所以另一個還是 61.230.138.42 09/13
→ cutilis:無法辨認DNA吧 61.230.138.42 09/13
> -------------------------------------------------------------------------- <
作者: neo15 (愛上一個不該愛的人) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請問兩個cutting site很接近會影響cut的嗎
時間: Tue Sep 13 17:24:23 2005
※ 引述《alla (只想開開心心過生活)》之銘言：
: 補充一下問題
: Xho1 BamH1
: / /
: ACTCGAGGATCCA
: TGAGCTCCTAGGT
: / /
: Xho1 BamH1
: 請問這樣有影響嗎
: 可以順便跟我說在哪裡可以找到資料
: 而如果只要cut這兩個site又怎麼做
: 如何分開切
: 謝謝囉
之前曾經做過和你類似的實驗~
當時只是用Vector NTI 確定可以切，還沒有考慮酵素的立體結構便做下去了~
結果是....可以切，但效率不高，3 hours 切下的量不到正常切位的50%~
增加反應時間、改變濃度，甚至換了一家restriction enzyme 但結果都一樣
後來查Paper才知道立體障礙~但後來這個實驗停了~再來就忘了 (好久了)
不過我記得查到的那篇paper有提到要怎麼切這種 cutting site的方法~
好像是在 Protein Expression and Purification or Biotechnology Progress
我找到再Po上來~
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 211.74.220.79
> -------------------------------------------------------------------------- <
發信人: gilchang.bbs@bbs.wretch.cc (到頭來只是個墻外行人), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題] 請問兩個cutting site很接近會影響cut的嗎
發信站: 無名小站 (Wed Sep 14 18:41:50 2005)
轉信站: ptt!Group.NCTU!grouppost!Group.NCTU!wretch
※ 引述《alla.bbs@ptt.cc (只想開開心心過生活)》之銘言：
> 我再做將insert插入vector的實驗
> 用兩個不同的enzyme去cut
> 用BamH1跟Xho1
> 兩個的cutting site很接近
> 我算過如果能切
> 切下來的小片段大概只有5bp
> 所以會因為如此影響嗎
> 請各位大大幫我解答一下
不懂?
Bam HI與Xho I都是切出sticky end的enzymes
那你說的5bp是指切出的最短product中dsDNA部份是5bp?
還是指長度是相當於5bp?
如是前者, 那沒什麼那問題, 盡量切吧.
如果是後者, 那建議你換個RE site,
要不然, 硬要切也行, 只是效果會差很多.
--
夫兵者不祥之器物或惡之故有道者不處君子居則貴左用兵則貴右兵者不祥之器非君子
之器不得已而用之恬淡為上勝而不美而美之者是樂殺人夫樂殺人者則不可得志於天下
矣吉事尚左凶事尚右偏將軍居左上將軍居右言以喪禮處之殺人之眾以哀悲泣之戰勝以
喪禮處之道常無名樸雖小天下莫能臣侯王若能守之萬物將自賓天地相合以降甘露民莫
之令而自均始制有名名亦既有夫亦將知止知止可以不殆譬道之在天 140.109.40.39海