推 blence:請問你通常是怎麼clone一個gene的cds？ 140.109.40.29 07/28
關於RT-PCR
之前看書上寫說利用polyA當primer
因為要穿過3'UTR因此得到full length的mRNA較為困難
今天我想要獲得一個大概2000bp的產物
之後要把這個產物construct到vector上面
請問有人做過這種大小的嗎
又問這樣成功機率多大呢????
改用randem hexamer當primer成功機率會不會比較大???
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◆ From: 163.25.92.207
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作者: aggaci (挖拍狼喔!!) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請問RT-PCR
時間: Wed Jul 27 21:52:48 2005
※ 引述《telomere (我變了)》之銘言：
: 關於RT-PCR
: 之前看書上寫說利用polyA當primer
: 因為要穿過3'UTR因此得到full length的mRNA較為困難
我想你沒弄懂時麼是RT-PCR....
: 今天我想要獲得一個大概2000bp的產物
: 之後要把這個產物construct到vector上面
你的目的是什麼?protein expression?
: 請問有人做過這種大小的嗎
: 又問這樣成功機率多大呢????
: 改用randem hexamer當primer成功機率會不會比較大???
不會
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◆ From: 140.114.63.11
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作者: ndmcls (季勗) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請問RT-PCR
時間: Wed Jul 27 22:57:13 2005
※ 引述《telomere (我變了)》之銘言：
: 關於RT-PCR
: 之前看書上寫說利用polyA當primer
: 因為要穿過3'UTR因此得到full length的mRNA較為困難
同前一個網友的講法: 你沒弄懂什麼是 rt-pcr.
: 今天我想要獲得一個大概2000bp的產物
: 之後要把這個產物construct到vector上面
: 請問有人做過這種大小的嗎
當然做過, 但不可能用 3' race 就一次完成..... 好吧, 也許太武斷點,
可能性很低.
通常這還要再做 5' race.
: 改用randem hexamer當primer成功機率會不會比較大???
你要做 probe?
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◆ From: 140.109.57.147
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作者: telomere (我變了) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請問RT-PCR
時間: Thu Jul 28 00:15:24 2005
※ 引述《aggaci (挖拍狼喔!!)》之銘言：
: ※ 引述《telomere (我變了)》之銘言：
: : 關於RT-PCR
: : 之前看書上寫說利用polyA當primer
: : 因為要穿過3'UTR因此得到full length的mRNA較為困難
: 我想你沒弄懂時麼是RT-PCR....
: : 今天我想要獲得一個大概2000bp的產物
: : 之後要把這個產物construct到vector上面
: 你的目的是什麼?protein expression?
: : 請問有人做過這種大小的嗎
: : 又問這樣成功機率多大呢????
: : 改用randem hexamer當primer成功機率會不會比較大???
: 不會
Sorry 上面修正為....
oligo dT當primer，得到full length的cDNA困難
但是用randem hexamer當primer而得到full length的cDNA較容易
我是參考"基礎PCR 編者 張建國 張建裕醫師 (藝軒圖書出版社)"這本書的一段話呀....
p150-151
如果還有什麼不懂的地方請告訴我.....
做完reverse transcription後得，還要再利用PCR夾出2000bp的產物
之後要把這個產物construct到vector上，並放入E. coli當中
最後這個vector要送到真核生物的細胞中表現....所以目的是protein expression
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◆ From: 163.25.118.14
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作者: ndmcls (季勗) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請問RT-PCR
時間: Thu Jul 28 00:38:25 2005
※ 引述《telomere (我變了)》之銘言：
: oligo dT當primer，得到full length的cDNA困難
: 但是用randem hexamer當primer而得到full length的cDNA較容易
: 我是參考"基礎PCR 編者 張建國 張建裕醫師 (藝軒圖書出版社)"這本書的一段話呀....
醫生? 算了吧, 這種書別看了.
你先弄清楚 random hexamer 是什麼東西. random, 就是逢機的, 任意的,
hexamer 是六個 nt, random hexamer 就是任意的六個 nt.
你自己說, 既然是任意的, 你要怎麼去得到專一性 cDNA 的全長? 所以我
才問你, 是不是要做 probe.
你去找 3' race 及 5' race 的技術手冊, 人家會告訴你得到專一性 cDNA
的方法. 同時再去找 rt-pcr 的原理 (當然啦, 有 poly(A) 的都是真核生
物, 除非你告訴我你要做的是原核生物的 cDNA), 人家也會告訴你正確的
做法.
: 做完reverse transcription後得，還要再利用PCR夾出2000bp的產物
: 之後要把這個產物construct到vector上，並放入E. coli當中
: 最後這個vector要送到真核生物的細胞中表現....所以目的是protein expression
做太快, 省略太多步驟了啦.
我很好奇, 是你的老師要你這麼做的?
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◆ From: 140.109.57.147