[問題] 請問RT-PCR

[ligase (真的不是距離嗎)]

我想要請問兩個問題.....


抽完RNA後 想要知道RNA有沒有degrade

於是跑了一般DNA的agarose gel

請問有出現的兩條band是什麼？？



再來就是

有時候RT-PCR做完之後　跑膠卻看到一整團smear的band

但是抽完RNA後　有跑電泳　確定沒有degrade

請問是什麼原因造成這些smear的band呢

謝謝:)

(我想RT應該是ok　因為GAPDH的band有出來　而且沒有smear..)

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 163.25.118.11
※ 編輯: ligase          來自: 163.25.118.11        (08/01 02:12)

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作者: Liebesleid (馬可夫尼可夫如是說) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請問RT-PCR
時間: Mon Aug  1 21:37:02 2005

※ 引述《ligase (真的不是距離嗎)》之銘言：
: 我想要請問兩個問題.....
: 抽完RNA後 想要知道RNA有沒有degrade
: 於是跑了一般DNA的agarose gel
: 請問有出現的兩條band是什麼？？

23s 16s

: 再來就是
: 有時候RT-PCR做完之後　跑膠卻看到一整團smear的band
: 但是抽完RNA後　有跑電泳　確定沒有degrade
: 請問是什麼原因造成這些smear的band呢
: 謝謝:)
: (我想RT應該是ok　因為GAPDH的band有出來　而且沒有smear..)

升溫吧

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 [Liebesleid]/home/Liebesleid <Liebesleid> make love
 make: Fatal error: Don't know how to make target `love'

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 140.112.78.45

> -------------------------------------------------------------------------- <

作者: mandible (生化...go go go !!) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請問RT-PCR
時間: Thu Aug  4 17:45:16 2005

※ 引述《Liebesleid (馬可夫尼可夫如是說)》之銘言：
: ※ 引述《ligase (真的不是距離嗎)》之銘言：
: : 我想要請問兩個問題.....
: : 抽完RNA後 想要知道RNA有沒有degrade
: : 於是跑了一般DNA的agarose gel
: : 請問有出現的兩條band是什麼？？
: 23s 16s
: : 再來就是
: : 有時候RT-PCR做完之後　跑膠卻看到一整團smear的band
: : 但是抽完RNA後　有跑電泳　確定沒有degrade
: : 請問是什麼原因造成這些smear的band呢
: : 謝謝:)
: : (我想RT應該是ok　因為GAPDH的band有出來　而且沒有smear..)
: 升溫吧

個人覺得應該是條件沒有設好...
例如anneal的溫度..enzyme的濃度~~
如果你GADPH有跑出來...這個CDNA應該就不是什麼問題...
你的RT-PCR用多少CDNA???太多也有可能會SMEAR

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 203.71.87.1
推 ghjkl:cDNA直接PCR就好了吧幹麻要RT阿
推 mandible:你誤會我的意思..我是說..你PCR用多少CDNA
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發信人: [e-mail] (那就這樣吧~~), 看板: Biotech
標  題: Re: [問題] 請問RT-PCR
發信站: 新綠園 (Sat Aug 20 12:24:59 2005)
轉信站: ptt!Group.NCTU!grouppost!Group.NCTU!ncyusa

※ 引述《[e-mail] (生化...go go go !!)》之銘言：
※ 引述《Liebesleid (馬可夫尼可夫如是說)》之銘言：
: ※ 引述《ligase (真的不是距離嗎)》之銘言：
: : 我想要請問兩個問題.....
: : 抽完RNA後 想要知道RNA有沒有degrade
: : 於是跑了一般DNA的agarose gel
: : 請問有出現的兩條band是什麼？？
: 23s 16s
看抽什麼摟 真核 18S 28S
: : 再來就是
: : 有時候RT-PCR做完之後　跑膠卻看到一整團smear的band
: : 但是抽完RNA後　有跑電泳　確定沒有degrade
: : 請問是什麼原因造成這些smear的band呢
: : 謝謝:)
: : (我想RT應該是ok　因為GAPDH的band有出來　而且沒有smear..)
: 升溫

應該是primer dimer 也就是說可能溫度太高 primer不容易抓到你的模板
所以在annealing應該降溫

也或許denature的時間不夠 所以結構沒打開 primer bind不上去(predenature或
denature)(看你如果用poly T做RT 那還要看你PCR要抓的位置是不是很後面 會不會RT
效率不好 沒法做到你的抓的位置也不一定)

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