推 ShengChe:請問DMSO要用什麼溶劑稀釋呢? 07/15 12:56
推 apa9394:原PO是說在30-50ul的PCR mixture中加入微量DMSO.... 07/15 22:18
推 sindbis:沒錯沒錯, 原po專業, 2樓有經驗... 07/15 23:45
※ 引述《tsen (做實驗做到快窒息@.@)》之銘言：
: 我使用的primer是在405bp的位置
: 但是跑完膠之後 用UV照射後卻不見band出現
: 我同時間訂了三對primer其他兩對都做的出來
: 唯獨這對很奇怪
: po一下這對primer的資料
: Primer F：35mer, GC content：51%, Tm為66.8度
: Primer R：26mer, GC content：54%, Tm為61.1度
: 跑完之後是連雜band都沒有 好歹也出現個雜band阿
: 完全沒有東西讓人沒有頭緒阿 況且其他兩對都做的出來阿
: 會是primer F太長了嘛?
: 麻煩各位大師幫我看一下阿>"< 感謝!!!
=====>if 去除掉太一般的技術問題, ex: 某管PCR漏加dNTP, primer漏加一根...
(這些都要請原po注意到)
預測的PCR product size是405 bp, 應該不會有做不出來的問題
真的如你所言,
同樣的cDNA(我指一模一樣的同一批, 同一管)大家都做的出來,
只有這組primer做不出來的話....
如果問題在primer上
最可能情況有如下二種:
1. 請check一下primer sequence的最後一個mer, 是不剛好在那個gene的SNP處
個人經驗是primer 的最後一個nt如果mismatch, 是不可能做得出來的
上NCBI database查一下吧
2. 沒看到你的primer sequence, 我不知道你這組primer
是不是self-dimer太嚴重, if so, 降annealing temp不一定做得出來
個人建議於PCR mixture中加入DMSO, 幫忙把2級結構打開
記得DMSO conc. <5%
如果問題在cDNA上
要注意那個gene是inducible or constitutive expression??
是不是induce得不好?? check一下藥過期了沒
呼... 我還是去做實驗好了, 打字手真酸...
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