› 精華區beta Biotech 關於我們 聯絡資訊
作者lakerjackt (N￾N )
看板Biotech
標題請問有人做過sequencing嗎?
時間Wed Mar 9 20:05:17 2005
哈....又來麻煩各位大大........ 我最近又碰到瓶頸了..... 就是最近在做sequencing....做了四次...第一次成功定出.. 但後來三次都貢辜....><!! 我學長說多練習就會做出來了..... 但我始終覺的我該做的都做了阿...會不會是在慢慢吸酒精出來時... 不小心把DNA吸掉...但我也滿小心慢慢吸了阿......!!! 可是就是貢辜........ 所以想請問有做過的大大...我因該要注意哪些細節... 謝謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 61.70.173.237 > -------------------------------------------------------------------------- < 發信人: ANUS.bbs@bbs.badcow.com.tw (watch it fly by), 看板: Biotech 標 題: Re: 請問有人做過sequencing嗎? 發信站: 不良牛牧場 (Wed Mar 9 20:16:41 2005) 轉信站: ptt!Group.NCTU!grouppost!Group.NCTU!SimFarm ※ 引述《lakerjackt.bbs@ptt.cc (N￾N )》之銘言： : 哈....又來痲煩各位大大........ : 我最近又碰到貧頸了..... : 就是最近在做sequencing....做了四次...第一次成功定出.. : 但後來三次都貢辜....><!! 濃度太低? 還是sequencing出來有很多"N"? : 我學長說多練習就會做出來了..... : 但我始終覺的我該做的都做了阿...會不會是在慢慢吸酒精出來時... : 不小心把DNA吸掉...但我也滿小心慢慢吸了阿......!!! 不知道你是不是抽large-scale DNA? ._. : 可是就是貢辜........ : 所以想請問有做過的大大...我因該要注意哪些細節... : 謝謝 -- ★ ☆ / ★ ☆ / / ★ / ☆ / ★ ☆ ★ ☆ ★ ☆ 你是巨大的海洋 我是雨下在妳身上 我失去自己的形狀 我看到遠方 愛情的模樣 曾經孤單的徬徨 曾經相信曾經失望 妳穿過重重的迷惘 那愛的慌張 終於要解放 你是誰 教我狂戀 教我勇敢地挑戰全世界 在一樣的身體裡面 一樣有愛與被愛的感覺 我愛誰 已無所謂 沒有誰能將愛情劃界限 在一樣地身體裡面 迷樣的魔力卻是更強烈 星星在夜空中閃亮 星空下我不停流浪 此生我無知的奔忙 因為你眼光 都化成了光亮 這世界全部的漂亮 不過妳可愛的模樣 妳讓我舉雙手投降 跨出了城牆 長出了翅膀 -- ╭──── Origin:<不良牛牧場> bbs.badcow.com.tw (210.200.247.200)─────╮ │ ↘ Welcome to SimFarm BBS -- From : [140.112.121.97] │ ╰◣◣◢ ◢◢《不良牛免費撥接→電話:40586000→帳號:zoo→密碼:zoo》 ◣◣◢ ─╯ > -------------------------------------------------------------------------- < 作者: lakerjackt (N￾N ) 看板: Biotech 標題: Re: 請問有人做過sequencing嗎? 時間: Wed Mar 9 20:44:22 2005 ※ 引述《ANUS.bbs@bbs.badcow.com.tw (watch it fly by)》之銘言： : ※ 引述《lakerjackt.bbs@ptt.cc (N￾N )》之銘言： : : 哈....又來痲煩各位大大........ : : 我最近又碰到貧頸了..... : : 就是最近在做sequencing....做了四次...第一次成功定出.. : : 但後來三次都貢辜....><!! : 濃度太低? 還是sequencing出來有很多"N"? 我是用學長他們的量來加..因該不會有錯吧.. ....哈..sequencing沒東東...(污染的不算) : : 我學長說多練習就會做出來了..... : : 但我始終覺的我該做的都做了阿...會不會是在慢慢吸酒精出來時... : : 不小心把DNA吸掉...但我也滿小心慢慢吸了阿......!!! : 不知道你是不是抽large-scale DNA? ._. 我是抽約5Kb的plasmid 來定序的 : : 可是就是貢辜........ : : 所以想請問有做過的大大...我因該要注意哪些細節... : : 謝謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 61.70.173.237 > -------------------------------------------------------------------------- < 作者: enisx (PhD板 歡迎您的光臨指導) 看板: Biotech 標題: Re: 請問有人做過sequencing嗎? 時間: Wed Mar 9 21:51:42 2005 是用那種系統的定序儀?? 如果能更清楚的敘述一下 或許會比較容易發現問題!! -- 『要用輕盈的腳步，跨過生命中沉重的事！』 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.25.191 > -------------------------------------------------------------------------- < 作者: chickling (小雞) 看板: Biotech 標題: Re: 請問有人做過sequencing嗎? 時間: Thu Mar 10 14:36:46 2005 ※ 引述《lakerjackt (N￾N )》之銘言： : 哈....又來痲煩各位大大........ : 我最近又碰到貧頸了..... : 就是最近在做sequencing....做了四次...第一次成功定出.. : 但後來三次都貢辜....><!! : 我學長說多練習就會做出來了..... : 但我始終覺的我該做的都做了阿...會不會是在慢慢吸酒精出來時... : 不小心把DNA吸掉...但我也滿小心慢慢吸了阿......!!! : 可是就是貢辜........ : 所以想請問有做過的大大...我因該要注意哪些細節... : 謝謝 想請問一下你下的濃度大約多少??目前我下的總量約200-500ng, 不過總量要是150ng也是可以的~~但是下的量太高反而不好~~ 還有你的在吸酒精的時候不要去吸到不透明的東西就行了吧~~~ 我想~~~大多會做不出來可能是sample的濃度跟你所下的primer較有關係吧~~~ 因為我都是用3730做定序的而藥品也全都是ABI的貨~~~ 所以通常酒精去除後~~便加入HiD去溶了~~~ 還有要上機之前~~~也要先將sample denatureㄛ~~~95C 5min~~~~ 大致上就這些吧~~~你在試試看囉~~~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.84.165 > -------------------------------------------------------------------------- < 作者: lakerjackt (N￾N ) 看板: Biotech 標題: Re: 請問有人做過sequencing嗎? 時間: Sat Mar 12 14:33:50 2005 後來...我就用生技公司附贈的SAMPLE和PRIMER...來再做一次定序... 結果成功定出...所以應該就不是我技術的問題...^^ 至於PRIMER和sample....加量的設計我也是有注重到.. 我想不是我plasmid濃度不夠...就是primer有問題..... --------------------------------------- 謝謝...你講的那些step我都有作......^^ ※ 引述《chickling (小雞)》之銘言： : ※ 引述《lakerjackt (N￾N )》之銘言： : : 哈....又來痲煩各位大大........ : : 我最近又碰到貧頸了..... : : 就是最近在做sequencing....做了四次...第一次成功定出.. : : 但後來三次都貢辜....><!! : : 我學長說多練習就會做出來了..... : : 但我始終覺的我該做的都做了阿...會不會是在慢慢吸酒精出來時... : : 不小心把DNA吸掉...但我也滿小心慢慢吸了阿......!!! : : 可是就是貢辜........ : : 所以想請問有做過的大大...我因該要注意哪些細節... : : 謝謝 : 想請問一下你下的濃度大約多少??目前我下的總量約200-500ng, : 不過總量要是150ng也是可以的~~但是下的量太高反而不好~~ : 還有你的在吸酒精的時候不要去吸到不透明的東西就行了吧~~~ : 我想~~~大多會做不出來可能是sample的濃度跟你所下的primer較有關係吧~~~ : 因為我都是用3730做定序的而藥品也全都是ABI的貨~~~ : 所以通常酒精去除後~~便加入HiD去溶了~~~ : 還有要上機之前~~~也要先將sample denatureㄛ~~~95C 5min~~~~ : 大致上就這些吧~~~你在試試看囉~~~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 61.70.173.237 > -------------------------------------------------------------------------- < 發信人: ANUS.bbs@bbs.badcow.com.tw (睡 回 籠 覺 別吵), 看板: Biotech 標 題: Re: 請問有人做過sequencing嗎? 發信站: 不良牛牧場 (Sat Mar 12 15:13:00 2005) 轉信站: ptt!Group.NCTU!grouppost!Group.NCTU!SimFarm 你是PCR完後 拿product去送sequencing? 如果你有跑電泳稍微check片段大小的話 稍微可以估計一下濃度 我以前也曾濃度太低送sequencing XD ※ 引述《lakerjackt.bbs@ptt.cc (N￾N )》之銘言： : 後來...我就用生技公司附贈的SAMPLE和PRIMER...來再做一次定序... : 結果成功定出...所以應該就不是我技術的問題...^^ : 至於PRIMER和sample....加量的設計我也是有注重到.. : 我想不是我plasmid濃度不夠...就是primer有問題..... : --------------------------------------- : 謝謝...你講的那些step我都有作......^^ : ※ 引述《chickling (小雞)》之銘言： : : 想請問一下你下的濃度大約多少??目前我下的總量約200-500ng, : : 不過總量要是150ng也是可以的~~但是下的量太高反而不好~~ : : 還有你的在吸酒精的時候不要去吸到不透明的東西就行了吧~~~ : : 我想~~~大多會做不出來可能是sample的濃度跟你所下的primer較有關係吧~~~ : : 因為我都是用3730做定序的而藥品也全都是ABI的貨~~~ : : 所以通常酒精去除後~~便加入HiD去溶了~~~ : : 還有要上機之前~~~也要先將sample denatureㄛ~~~95C 5min~~~~ : : 大致上就這些吧~~~你在試試看囉~~~ -- ★ ☆ / ★ ☆ / / ★ / ☆ / ★ ☆ ★ ☆ ★ ☆ 你是巨大的海洋 我是雨下在妳身上 我失去自己的形狀 我看到遠方 愛情的模樣 曾經孤單的徬徨 曾經相信曾經失望 妳穿過重重的迷惘 那愛的慌張 終於要解放 你是誰 教我狂戀 教我勇敢地挑戰全世界 在一樣的身體裡面 一樣有愛與被愛的感覺 我愛誰 已無所謂 沒有誰能將愛情劃界限 在一樣地身體裡面 迷樣的魔力卻是更強烈 星星在夜空中閃亮 星空下我不停流浪 此生我無知的奔忙 因為你眼光 都化成了光亮 這世界全部的漂亮 不過妳可愛的模樣 妳讓我舉雙手投降 跨出了城牆 長出了翅膀 -- ╭──── Origin:<不良牛牧場> bbs.badcow.com.tw (210.200.247.200)─────╮ │ ↘ Welcome to SimFarm BBS -- From : [140.112.121.97] │ ╰◣◣◢ ◢◢《不良牛免費撥接→電話:40586000→帳號:zoo→密碼:zoo》 ◣◣◢ ─╯ > -------------------------------------------------------------------------- < 作者: chickling (小雞) 看板: Biotech 標題: Re: 請問有人做過sequencing嗎? 時間: Sat Mar 12 15:26:52 2005 ※ 引述《lakerjackt (N￾N )》之銘言： : 後來...我就用生技公司附贈的SAMPLE和PRIMER...來再做一次定序... : 結果成功定出...所以應該就不是我技術的問題...^^ : 至於PRIMER和sample....加量的設計我也是有注重到.. : 我想不是我plasmid濃度不夠...就是primer有問題..... : --------------------------------------- : 謝謝...你講的那些step我都有作......^^ 那想要請問你一下~ 你是用那種的primer呢??? 因為大多的plasmid上面都有M13或是T7 若是你有T7的位置的話~~建議還是用此primer會較好~~ 因為我之前曾經做過用M13去跑定序~ 結果相當的差~~同樣的sample用T7去跑~~ 每個都是相當的漂亮阿~~~ 給你我這做定序的條件及濃度~~ plasmid DNA 2ul(總濃度約150-500ng) buffer 1.5ul big Dye 1ul primer(T7) 1ul(濃度3.2uM or 3.2pmole) H2O 4.5ul ----------------------------- total 10ul PCR program 96C 1min ------------ 25cycle 96C 10sec 50C 5sec 60C 4min ------------- 之後就做酒精沉澱~~~~ 看看跟你的做法有沒有差異~~~供你參考看看~~~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.84.165 > -------------------------------------------------------------------------- < 作者: lakerjackt (N￾N ) 看板: Biotech 標題: Re: 請問有人做過sequencing嗎? 時間: Sat Mar 12 15:40:54 2005 我是用M13去定.......改天我看看plasmid上有沒有T7 promoter..... 再改用T7試試....... 謝啦!!! ※ 引述《chickling (小雞)》之銘言： : ※ 引述《lakerjackt (N￾N )》之銘言： : : 後來...我就用生技公司附贈的SAMPLE和PRIMER...來再做一次定序... : : 結果成功定出...所以應該就不是我技術的問題...^^ : : 至於PRIMER和sample....加量的設計我也是有注重到.. : : 我想不是我plasmid濃度不夠...就是primer有問題..... : : --------------------------------------- : : 謝謝...你講的那些step我都有作......^^ : 那想要請問你一下~ : 你是用那種的primer呢??? : 因為大多的plasmid上面都有M13或是T7 : 若是你有T7的位置的話~~建議還是用此primer會較好~~ : 因為我之前曾經做過用M13去跑定序~ : 結果相當的差~~同樣的sample用T7去跑~~ : 每個都是相當的漂亮阿~~~ : 給你我這做定序的條件及濃度~~ : plasmid DNA 2ul(總濃度約150-500ng) : buffer 1.5ul<---------我加1ul : big Dye 1ul<---------我加2ul : primer(T7) 1ul(濃度3.2uM or 3.2pmole) : H2O 4.5ul<---------我加4ul..... : ----------------------------- : total 10ul : PCR program : 96C 1min : ------------ : 25cycle : 96C 10sec : 50C 5sec : 60C 4min : ------------- : 之後就做酒精沉澱~~~~ : 看看跟你的做法有沒有差異~~~供你參考看看~~~ 其實加的量劑沒差很多...應影響不大....... -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 61.70.173.237