請問microarray相關問題

[aggaci (五子棋啦)]

  最近因要做microarray..
  (我是用我表現出來的蛋白質去處理細胞, 而我發現這個蛋白質會進入細胞
   但不知作用為何)

  我門老闆跑去問了國衛院某個老師
  它跟我門老闆說
  作microarray前必須要先確定我的蛋白質會進入""每一個細胞""
  這樣才能確定每個細胞狀態都是一樣的

  哇靠  倒是給了我一個難題了
  要如何確定??
  把我的蛋白接GFP 然後去處理細胞 再跑flow cytometry嗎??
  這....光表現純化就可是大工程了

  而且我想跑出來分布圖應該是常態分布那種圖吧?

  所以想請教各位有經驗的人  你們有先確定這個步驟嗎?

  謝謝
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 作者  aggaci (五子棋啦)                                    看板  Biotech     
 標題  Re: 請問microarray相關問題                                             
 時間  Sun Dec  5 15:58:07 2004                                               
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※ 引述《oplz (oplz)》之銘言：
: Sorry 我有點不太瞭解你的意思...
: 你是指你的 protein 加入 medium 中會從細胞外進入細胞中嗎?
: 有些 viral protein 帶有 pilot peptide 的確會這樣
: 所以有人將他拿來當 transfection vector 用..
: 請問你是在做 viral protein 嗎?

  不是ㄝ....^^

: 你們問的是誰啊 JL 莊 ?? or SF 蔡 ??

  莊志立老師阿...

: 我不覺得真的會有每個細胞狀態都一樣的這種 sample 存在..

  其實我也這麼覺得                  

: 所以我想或許是我沒有瞭解你講的意思..

  我門老師的意思是醬子
  其實有可能是我門老師會錯意了

: 下面是我的想法
: 如果你的 protein 會像 pilot peptide 一樣進入細胞
: 就用這樣的方式將 protein 送入細胞
: 因為你不知道建 stable clone 這些方法表現出來的 protein 有沒有一些
: post-transcriptional/translational differences..
: 接 GFP 也多少有影響 protein 的風險存在
: 用 flow 收出來就跟你說的一樣是一常態分佈..
: 根本的原因是你送進去的結果就是那樣的分佈...

  ㄜ....這句話我不太懂ㄝ....^^|||

: 如果這是自然的狀況 我覺得就這樣送進細胞會比較好一點.
: 另外 如果是 function unknown 的 novel protein,
: 除非該 protein 是 transcription related protein..
: 用 microarray 看 mRNA level 可能不會是一個好的優先選擇

  但我的想法是這樣                             
  我的蛋白質功能還不知道
  我想經由microarray去掃描所有的基因在經由我的蛋白處理後
  哪些基因turn on 哪些基因repress了
  再回過來判斷我的蛋白進入細胞 他做了什麼事?
  很多情況不都是醬子嗎
  apoptosis時 caspase相關基因都會enhance表現

: 看 protein level 的 interacting protein 會比較有機會找出他的功能..
: 給你參考

  嗯   其實我門實驗室有人再作這個部份(以yeast two hybrid)
  但是我個人覺得這個方法有點是亂槍打鳥
  常常釣出來的蛋白 interaction很強 但是不知道怎麼解釋
  而且....在步確定它的function就先預設他會跟某些蛋白結合  這個有點冒險

  呵 謝謝你的迴應嘍....                                                 
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推 littlesky:if I were you,I would try 2D PAGE first
推 oplz:果然是 莊 ....... :)
→ oplz:如果你想看細胞 turn on 那些 protein 來
→ oplz:反應你的 protein.. 首先你要知道要看的時
→ oplz:間點在哪裡.. 12 or 24 or 36 hrs later?
→ oplz:不然 microarray 很可能就算有影響也看不
→ oplz:到..相反的, 看 interacting protein 會比
→ oplz:較好..至少 narrow down 了可能的功能範圍
→ oplz:如果你覺得 Y2H 會帶給你太多假的或無關的
→ oplz:information...try microarray..你的問題
→ oplz:不見得就會比較少的..... FYI.
→ oplz:另外為甚麼你的 protein 可以從 medium
→ oplz:跑進細胞裡面去啊?有已知的 mechanism 嗎?
→ oplz:蠻有興趣知道的.....
→ oplz:另外 Y2H 那邊的部分..找出 interacting
→ oplz:protein 的目的就是要找出該 protein 可能
→ oplz:有的功能.. 我的想法剛好跟你是相反的..
→ oplz:mRNA to protein 間畢竟還有不少調控變化
→ oplz:從 protein 找 function 會比較容易且直接
→ oplz:一點...FYI.
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 作者  aggaci (五子棋啦)                                    看板  Biotech     
 標題  Re: 請問microarray相關問題                                             
 時間  Mon Dec  6 01:50:22 2004                                               
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: : 用 microarray 看 mRNA level 可能不會是一個好的優先選擇
: : 看 protein level 的 interacting protein 會比較有機會找出他的功能..
: : 給你參考
:  為何不作 2D PAGE

  這個問題當初我有想過
  一開始我本來是想做2D沒錯 因為身邊有人很熟
  但是再聽過一場microarray的演講後 就改變了想法
  因為後來 我覺得2D流程太複雜 一個點拿去打mass 或malditolf(好像有拼錯..??)
  要價6000~8000....(有沒更便宜或更貴的就需要大家補充了)
  而且好像...打出來是"keratin"的機率很高?!
  那根microarray一次scan幾萬個點比起來
  microarray似乎比較划算

:  有關 protein 送入細胞的問題可以利用抗體進行偵測...
:  雖然一樣會有分佈的問題..

  是阿!這是收""所有""細胞...           
  但是能確定""每個細胞""情形都一樣嗎?
  所以我才說老闆給了我一個難題
  大概是他沒做過細生實驗.....以為很簡單吧?!

  唉...老闆麻...都馬只會出張嘴!馬的勒!


:  但是你跑完 2D 後用 抗體偵測後可以確定你
:  每次的實驗蛋白質送入cell內的效果是一樣的 (至少每次送進去的量分佈差不多)
:  同時microarray 價格實在很高...

  我不覺得....microarray價格高是因為他看的點多ㄚ~~^^

:  你的確也比較難說明你的蛋白質有進入每個細胞
:  每次的實驗只要有些微的差距 都會造成實驗的影響..
:  只要幾次control 沒調好
:  錢就飛了.........................
:  data 也無法發表
:  2D 感覺比較在價格上平易近人一點.. 跑爛了 重跑一張也比較不會心疼

  ㄜ....也是啦!                                  
:  而且有western 的存在 要告訴別人你的蛋白質有送進去的證據也直接了許多
:  (因為在同一張圖上 跟microarray 要額外在做一張圖代表你蛋白質有進去更有力許多)
:  從 2D 的實驗發現到有一些證據後 再在進入microarray的實驗分析..
:  也許在流程的規劃上比較有效率

  其實我是很怕2D很容易污染...而且價格就我的認知筆microarray來得高...


  Thank you for your reply~~

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→ littlesky:太貴啦 我打MS TOF 也只要幾百塊
→ littlesky:array 也會有自己的問題與限制괠非萬靈丹
推 littlesky:array repeat個幾次會要命 2D 直到以質譜ꤠ
→ littlesky:前 價格還是比array便宜的多..
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 作者  [email protected] (baroque),                          看板  Biotech     
 標題  Re: 請問microarray相關問題                                             
 時間  批踢踢參 (Wed Dec  8 14:13:39 2004)                                    
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※ 引述《[email protected] (五子棋啦)》之銘言：
如果你的細胞不是homogenized population
micrarray出來的data會很不可靠
很多時候只會做出一堆crap
GEO上面看似許多gene expression data
其實可靠的是少數

舉例而言
目前mammalian cell cycle兩組gene expression data
各自identify了800-900個所謂的cyclic genes
但重複的只有80個
雖然所用的cell line不同
但也太誇張了
有一個根本的原因是
synchronization方面技術上的限制      
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 作者  aggaci (五子棋啦)                                    看板  Biotech     
 標題  Re: 請問microarray相關問題                                             
 時間  Sat Dec 11 17:09:59 2004                                               
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推 littlesky:if I were you,I would try 2D PAGE first
  嗯   我前幾天從amershame訂了一堆跑2D的東西
  過幾天準備開工狂跑"兩滴"
  呵 謝謝你的建議嘍...

推 oplz:果然是 莊 ....... :)
→ oplz:如果你想看細胞 turn on 那些 protein 來
→ oplz:反應你的 protein.. 首先你要知道要看的時
→ oplz:間點在哪裡.. 12 or 24 or 36 hrs later?

  對了  我有個問題
  一般的細胞  從transcription => splicing => translation
  要多久時間勒.............???
  很怪的問題~~~^^|||

→ oplz:不然 microarray 很可能就算有影響也看不
→ oplz:到..相反的, 看 interacting protein 會比
→ oplz:較好..至少 narrow down 了可能的功能範圍
→ oplz:如果你覺得 Y2H 會帶給你太多假的或無關的
→ oplz:information...try microarray..你的問題
→ oplz:不見得就會比較少的..... FYI.
→ oplz:另外為甚麼你的 protein 可以從 medium
→ oplz:跑進細胞裡面去啊?有已知的 mechanism 嗎?
→ oplz:蠻有興趣知道的.....
  哈
  這一篇是我門學長出的 paper 你有興趣可以去看看
  http://www.biochemj.org/bj/382/0841/bj3820841.htm
  關於這個
  我個人的想法是 這個protein它可能在根membrane上的receptor binding時
  就已引發了下游的signal transduction
  而他進細胞只是為了被degrade而已....(degradation這部分我有做出來)

→ oplz:另外 Y2H 那邊的部分..找出 interacting
→ oplz:protein 的目的就是要找出該 protein 可能
→ oplz:有的功能.. 我的想法剛好跟你是相反的..
→ oplz:mRNA to protein 間畢竟還有不少調控變化
→ oplz:從 protein 找 function 會比較容易且直接
→ oplz:一點...FYI.

   呵   謝謝你!

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推 oplz:for your first question: It dependents.
→ oplz:如果你要做 degradation..可以試著先找
→ oplz:一些 degradation motif sequence..
→ oplz:也許會有幫助..但我還是在想 microarray
→ oplz:可以為你的實驗帶來多少幫助...
推 oplz:oh! and thanks for the paper info!!!
→ oplz:的確 Y2H 在找 membrane protein 上面會比
→ oplz:較麻煩...在你的 case 可能不是個好方法..
推 aggaci:ㄜ...我是要做這個protein造成的返應摟...
→ aggaci:也就是signal transduction...:)
推 aggaci:哈 至於他進細胞怎麼死的 我是沒啥興趣啦뀠
→ aggaci:因為要做很多mutant clone..
→ aggaci:我分生做的差...所以...^^|||