推 blence:做PCR不是溶在水中比較好？ 61.31.133.170 01/29
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作者: aggaci (五子棋啦) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] genomic DNA的萃取
時間: Sat Jan 29 00:52:57 2005
※ 引述《nothingelse (上邪)》之銘言：
: 實驗室要check老鼠的genotype是抽尾巴的DNA然後run PCR
: 不過我抽的品質高高低低 有時候好有時候很差
: 我用的方法是傳統的萃取 不是用kit的
: 先把尾巴lyse以後 (有加proteinase K 和 RNase A)
: 然後再加上phenol mix後離心
: 再用phenol-chloroform mix後離心
: chloroform-IAA mix再離心一次
: 最後用isopropanol上下搖四下就用yellow tip把DNA纏出來 (約繞20-30下)
: 然後再用70和100%酒精 wash一下
: 溶在TE裡面然後放在4度隔夜後作PCR
: 有時候我明明有纏到DNA結果跑出來的PCR竟然一條band都沒有
: 不知道是不是溶解的過程發生了什麼問題 (我抽好以後放在室溫約六個小時才加TE)
: 還是PCR有問題........
genomic DNA跑PCR 跑不出來很正常
annealing temperature先往下調調看
denature久一點(如一分鐘)
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◆ From: 140.114.100.165
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發信人: [email protected] (死胖子超怕熱), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題] genomic DNA的萃取
發信站: 不良牛牧場 (Sat Jan 29 00:58:57 2005)
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※ 引述《[email protected] (上邪)》之銘言：
: 實驗室要check老鼠的genotype是抽尾巴的DNA然後run PCR
: 不過我抽的品質高高低低 有時候好有時候很差
: 我用的方法是傳統的萃取 不是用kit的
: 先把尾巴lyse以後 (有加proteinase K 和 RNase A)
: 然後再加上phenol mix後離心
: 再用phenol-chloroform mix後離心
phenol-chloroform多過幾次....
小弟我雖然沒剪過老鼠尾巴
但是根據抽小小phage DNA的經驗....過個20多次都不為過阿 :~~~
: chloroform-IAA mix再離心一次
: 最後用isopropanol上下搖四下就用yellow tip把DNA纏出來 (約繞20-30下)
用isopropanol或是95%Etoh前可以拿去-20℃冰一下
: 然後再用70和100%酒精 wash一下
: 溶在TE裡面然後放在4度隔夜後作PCR
溶的時候可以考慮用個65℃
: 有時候我明明有纏到DNA結果跑出來的PCR竟然一條band都沒有
如果DNA沒抽乾淨 不只PCR,恐怕連RE都切不太動
: 不知道是不是溶解的過程發生了什麼問題 (我抽好以後放在室溫約六個小時才加TE)
: 還是PCR有問題........
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其實我都只有碰過proK. XDDDD
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作者: wensing (煉金術：等價交換 ) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] genomic DNA的萃取
時間: Sat Jan 29 01:33:57 2005
※ 引述《nothingelse (上邪)》之銘言：
: 實驗室要check老鼠的genotype是抽尾巴的DNA然後run PCR
: 不過我抽的品質高高低低 有時候好有時候很差
: 我用的方法是傳統的萃取 不是用kit的
: 先把尾巴lyse以後 (有加proteinase K 和 RNase A)
: 然後再加上phenol mix後離心
: 再用phenol-chloroform mix後離心
: chloroform-IAA mix再離心一次
: 最後用isopropanol上下搖四下就用yellow tip把DNA纏出來 (約繞20-30下)
: 然後再用70和100%酒精 wash一下
: 溶在TE裡面然後放在4度隔夜後作PCR
建議：改用 10 mM tris buffer (pH = 8.5) 溶之 或 ddH2O (ph=7~8.5)
因為EDTA會影響PCR的結果，特別是pcr的buffer含有Mg+2 或外加Mg+2
: 有時候我明明有纏到DNA結果跑出來的PCR竟然一條band都沒有
: 不知道是不是溶解的過程發生了什麼問題 (我抽好以後放在室溫約六個小時才加TE)
: 還是PCR有問題........
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wensing (ptt) = eular (kkcity)
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◆ From: 203.70.5.98
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發信人: [email protected] (fly fly fly~), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題] genomic DNA的萃取
發信站: 批踢踢參 (Sat Jan 29 03:59:34 2005)
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如果老鼠尾巴DNA只是為了做genotyping
可以試試以下short cut
50mM NaOH(60 microliter), 100度煮10到30秒
spin, 取上清液
neutralize with 50 microliter 1M Tris-HCl pH=8.0
spin, 取上清液
取max 1.5 microliter for 15 microliter PCR reaction.
這是個口耳相傳的protocol 用過都說好
※ 引述《[email protected] (煉金術：等價交換 )》之銘言：
: ※ 引述《nothingelse (上邪)》之銘言：
: : 實驗室要check老鼠的genotype是抽尾巴的DNA然後run PCR
: : 不過我抽的品質高高低低 有時候好有時候很差
: : 我用的方法是傳統的萃取 不是用kit的
: : 先把尾巴lyse以後 (有加proteinase K 和 RNase A)
: : 然後再加上phenol mix後離心
: : 再用phenol-chloroform mix後離心
: : chloroform-IAA mix再離心一次
: : 最後用isopropanol上下搖四下就用yellow tip把DNA纏出來 (約繞20-30下)
: : 然後再用70和100%酒精 wash一下
: : 溶在TE裡面然後放在4度隔夜後作PCR
: 建議：改用 10 mM tris buffer (pH = 8.5) 溶之 或 ddH2O (ph=7~8.5)
: 因為EDTA會影響PCR的結果，特別是pcr的buffer含有Mg+2 或外加Mg+2
: : 有時候我明明有纏到DNA結果跑出來的PCR竟然一條band都沒有
: : 不知道是不是溶解的過程發生了什麼問題 (我抽好以後放在室溫約六個小時才加TE)
: : 還是PCR有問題........
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◆ From: 128.249.150.38
推 Nikio:跟我們實驗室的protocol一樣耶!! 140.109.32.8 01/30
→ Nikio:不過還是有時候會P不出來.... 140.109.32.8 01/30
→ Nikio:不過煮10~30sec夠嗎？我都煮到尾巴不見XD 140.109.32.8 01/30
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作者: jbking (我是吉米) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] genomic DNA的萃取
時間: Sun Jan 30 14:54:51 2005
我覺得如果沒有kit
這個方法應該最合適了
畢竟我看你原本的protocol
感覺有一些很重要的步驟你沒有做到
※ 引述《[email protected] (fly fly fly~)》之銘言：
: 如果老鼠尾巴DNA只是為了做genotyping
: 可以試試以下short cut
: 50mM NaOH(60 microliter), 100度煮10到30秒
: spin, 取上清液
: neutralize with 50 microliter 1M Tris-HCl pH=8.0
: spin, 取上清液
: 取max 1.5 microliter for 15 microliter PCR reaction.
: 這是個口耳相傳的protocol 用過都說好
: ※ 引述《[email protected] (煉金術：等價交換 )》之銘言：
: : 建議：改用 10 mM tris buffer (pH = 8.5) 溶之 或 ddH2O (ph=7~8.5)
: : 因為EDTA會影響PCR的結果，特別是pcr的buffer含有Mg+2 或外加Mg+2
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諸法皆空 自由自在
願主保佑你們~~~ ꌊ
~~阿門~~
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◆ From: 140.116.94.73
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作者: nothingelse (上邪) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] genomic DNA的萃取
時間: Mon Jan 31 01:43:58 2005
※ 引述《[email protected] (fly fly fly~)》之銘言：
: 如果老鼠尾巴DNA只是為了做genotyping
: 可以試試以下short cut
: 50mM NaOH(60 microliter), 100度煮10到30秒
: spin, 取上清液
: neutralize with 50 microliter 1M Tris-HCl pH=8.0
: spin, 取上清液
: 取max 1.5 microliter for 15 microliter PCR reaction.
: 這是個口耳相傳的protocol 用過都說好
原來還有這麼快速的protocol ^^~
感謝 我會試試看的
這個方法最後得到的DNA是只能用來run PCR嗎
southern blot可以嗎..?
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◆ From: 218.166.184.225
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發信人: [email protected] (fly fly fly~), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題] genomic DNA的萃取
發信站: 批踢踢參 (Mon Jan 31 12:08:35 2005)
轉信站: ptt!Group.NCTU!grouppost
※ 引述《[email protected] (上邪)》之銘言：
: ※ 引述《[email protected] (fly fly fly~)》之銘言：
: : 如果老鼠尾巴DNA只是為了做genotyping
: : 可以試試以下short cut
: : 50mM NaOH(60 microliter), 100度煮10到30秒
: : spin, 取上清液
: : neutralize with 50 microliter 1M Tris-HCl pH=8.0
: : spin, 取上清液
: : 取max 1.5 microliter for 15 microliter PCR reaction.
: : 這是個口耳相傳的protocol 用過都說好
: 原來還有這麼快速的protocol ^^~
: 感謝 我會試試看的
: 這個方法最後得到的DNA是只能用來run PCR嗎
: southern blot可以嗎..?
southern blot?
我沒試過
(老實說 我也不知道這樣萃取出來的DNA濃度如何)
我想假如genomic DNA的量夠的話應該是可以的
你可以用個control做個titration.
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◆ From: 69.151.219.206