推 vacule:換個competent cell 試試看 140.112.133.48 03/11
→ vacule:再試vector切一刀self-ligate看是否ligase壞掉 140.112.133.48 03/11
推 Liat:推換compentent cell 218.164.52.131 03/12
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作者: Yeee (小逸) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請問vector與insert都很大,篩不到菌...
時間: Fri Mar 11 22:17:24 2005
※ 引述《reegqoo (帳號老是不見＞＜)》之銘言：
: ※ 引述《Yeee (小逸)》之銘言：
: : 問一下喔。
: : 1. 為什麼要切兩次？XhoI 和 HpaI 好像可以用共通buffer的樣子？
: : （是因為其中一個切點不是unique，所以要先把外面一段DNA exclude掉嗎？）
: : 2. 跑膠的"膠"和器材有沒有確定是DNAse free呢?
: 1.因為我們覺得用單一酵素切比double digetion的效果好
: 2.我們沒有再用DNase來跑膠,所以不會有DNase存在
: 而且做完digetion後 還又做elute的動作選取所需片段 然後再跑電泳估濃度 所以DNA
: 沒有不見ꠊ
DNase其實應該是到處存在的呢。
並且也不是怕DNA不見，
DNase就算再貪吃，也不會一下子把這麼大的片段都吃光光。
怕的是人家喀呲喀呲地就把兩邊的切點吃掉了，這樣就很麻煩。
因此經驗上在跑膠以前，把膠和buffer拿去滅菌，
通常transformation efficiency也會提高一些。
您不妨試試。
並且既然是在做trouble shooting，也可以考慮做完ligation以後先跑跑看喔？
有這樣做嗎？就像上一個版友說的，檢查一下ligase有沒有正常運作。
在做transformation 的時候應該有做相對的control來確定competent cell的狀況吼。
所以這個因素應該很容易就可以排除。
Good luck...
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◆ From: 24.211.190.152
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發信人: [email protected] (你很煩人喔), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題] 請問vector與insert都很大,篩不到菌...
發信站: 無名小站 (Fri Mar 11 23:14:10 2005)
轉信站: ptt!Group.NCTU!grouppost!Group.NCTU!wretch
※ 引述《[email protected] (帳號老是不見＞＜)》之銘言：
> ※ 引述《Yeee (小逸)》之銘言：
> : 要不要講詳細一點呢？
> : 用什麼vector，怎麼切怎麼黏怎麼純化，等等。
> vector為Bin19有11k~ insert為8k~的PCR product
> 切位為Xho I及 Hpa I ,primer本身帶有切位
> 每次都是先切第一刀 clean up之後 再切第二刀
????????有機溶劑萃取後直接酒精沉澱? 還是有通column?
切多久? RE放多少?
> 利用T4 ligase 室溫2 hr or 16度 overnight ,transformation到Top10內
Top10? 你有用electroporation嗎?
> vector與insert都已經是過用不同比例去try
> 大致是這樣~如果還有疑問的地方請提出喲！～thanks！～
ligation完後可以先heat inactivate T4 DNA ligase
60度~70度十分鐘, 然後放冰上冷卻,
說明書上說這樣可以提高transformation efficiency
可共用buffer就做double digestion吧! 只要glycerol總濃度不超過5%都好.
我不清楚你說的一個一個切是怎麼進行的?
那是切完一個後馬上再加入另一種RE嗎? 那跟double沒啥不同.
若是中間還經過酒精沉澱....何苦來? 還得遺失一些sample....
另外, 在你run gel後看到的bands底下會不會有明顯的smear?
如果有, 那肯定是被DNase切了.
--
夫兵者不祥之器物或惡之故有道者不處君子居則貴左用兵則貴右兵者不祥之器非君子
之器不得已BLOG http://www.wretch.cc/blog 安西教練 我想寫日記 嗚嗚o志於天下
矣吉事尚左凶事尚右偏將軍居左上將軍居右言以喪禮處之殺人之眾以哀悲泣之戰勝以
喪禮處之道常無名樸雖小天下莫能臣侯王若能守之萬物將自賓天地相合以降甘露民莫
之令而自均始制有名名亦既有夫亦將知止知止可以不殆譬道之在天 140.109.40.39海
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作者: Mouseking (叫我老鼠王....-_-) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請問vector與insert都很大,篩不到菌...
時間: Sat Mar 12 15:05:18 2005
※ 引述《reegqoo (帳號老是不見＞＜)》之銘言：
: vector與insert都有好幾k一直都篩不到菌
: 甚至長都沒長
this kind of ligation is difficult to deal with,the best to solve your
problem is to try more times. I did a similar construct before, it took
me three months......
: 要如何改善呢
: 因為一直不知道是ligation效率不好還是transformation的問題
Both are possible. I recommend you to add 10% PEG8000 in the reaction
and put the sample in 4 C overnight.
This condition is better in order to stabilize DNA
: 對於這種長片段的都很難做
: 有沒有什麼好方法呢?感激不盡!~
Try more...............best wishes
--
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◆ From: 140.129.71.207
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作者: Lockey (楓城之子) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請問vector與insert都很大,篩不到菌...
時間: Sat Mar 12 15:28:29 2005
※ 引述《reegqoo (帳號老是不見＞＜)》之銘言：
: vector與insert都有好幾k一直都篩不到菌
: 甚至長都沒長
: 要如何改善呢
: 因為一直不知道是ligation效率不好還是transformation的問題
: 對於這種長片段的都很難做
: 有沒有什麼好方法呢?感激不盡!~
我的建議是
直接用electroporation試看看
說不定可以比較快
不過前提是control要先確定
1. 用一個parental Bin19 plasmid來做transformation, 確定transformation沒問題.
2. Bin19我沒用過, 這麼大的plasmid或許是low copy number, 所以要降低kanamycin
conc. 不過可以和前述的control比較, 知道需不需要降低.
3. 您原始primer設計上, 距離端點是否留有足夠的base pairs讓enzyme來切? 如果您
是直接以linear PCR products來切, 這點就比較重要. XhoI可能還好, HpaI可能要
留比較多. 如果是這方面的問題話, 就得重新design primer, 或是先將PCR products
接到PCR cloning vector後再切.
4. 將parental Bin19做XhoI and HpaI double digestion (可再用ligase)後
transformation, 當另一個control, 應該不會有transformants, 如果有的話, 就是
restriction enzymes出問題.
5. 如果有必要也要看看ligase是否有問題.
--
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◆ From: 218.167.31.52
※ 編輯: Lockey 來自: 218.167.118.198 (03/12 17:45)
※ 編輯: Lockey 來自: 218.160.43.65 (03/13 01:45)
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作者: fatorx (plastid) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請問vector與insert都很大,篩不到菌...
時間: Mon Mar 14 02:12:03 2005
※ 引述《Lockey (楓城之子)》之銘言：
: ※ 引述《reegqoo (帳號老是不見＞＜)》之銘言：
: : vector與insert都有好幾k一直都篩不到菌
: : 甚至長都沒長
: : 要如何改善呢
: : 因為一直不知道是ligation效率不好還是transformation的問題
: : 對於這種長片段的都很難做
: : 有沒有什麼好方法呢?感激不盡!~
: 我的建議是
: 直接用electroporation試看看
: 說不定可以比較快
: 不過前提是control要先確定
: 1. 用一個parental Bin19 plasmid來做transformation, 確定transformation沒問題.
: 2. Bin19我沒用過, 這麼大的plasmid或許是low copy number, 所以要降低kanamycin
: conc. 不過可以和前述的control比較, 知道需不需要降低.
: 3. 您原始primer設計上, 距離端點是否留有足夠的base pairs讓enzyme來切? 如果您
: 是直接以linear PCR products來切, 這點就比較重要. XhoI可能還好, HpaI可能要
: 留比較多. 如果是這方面的問題話, 就得重新design primer, 或是先將PCR products
: 接到PCR cloning vector後再切.
我會建議先將 PCR product 先接到 PCR cloning vector
再試著用primer 上的enzyme 將insert 切下來
有時候在primer 合成時會出錯 說不定primer 上的 enzyme site序列有問題
所以切不動 當然挑不到clone
這樣也可以解決 primer 端點長度不足的問題
: 4. 將parental Bin19做XhoI and HpaI double digestion (可再用ligase)後
: transformation, 當另一個control, 應該不會有transformants, 如果有的話, 就是
: restriction enzymes出問題.
: 5. 如果有必要也要看看ligase是否有問題.
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