各位先進好
想請教一個問題
我最近在用DNaseI切一長度約 360bp的DNA PCR product
想得到大小約 100bp的 random DNA fragments
在treat DNaseI之前 我有先跑膠確定 DNA在elution後還好好地存在著
但不知道為什麼 一切完之後再跑膠
我就什麼都看不到了....什麼band也沒有
我試了很多次 縮短反應時間 減低DNaseI的量
但還是都看不到
有可能是我DNA太少 切一切就看不到band
但我每一管大約都用700ng DNA去切
這樣是否還太少呢??
或想請問 還有什麼因素會導致我的東西都不見了呢??
這個星期都在做這個 卻一事無成
真擔心啊....還請各位提供一些建議!!
謝謝!!
--
白天不懂夜的黑
太陽不解月的悲
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◆ From: 140.109.224.35
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發信人: [email protected] (死胖子超怕熱), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題] 請問DNaseI
發信站: 不良牛牧場 (Sat Apr 30 02:55:23 2005)
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※ 引述《[email protected] (World Peace)》之銘言：
: 各位先進好
: 想請教一個問題
: 我最近在用DNaseI切一長度約 360bp的DNA PCR product
: 想得到大小約 100bp的 random DNA fragments
: 在treat DNaseI之前 我有先跑膠確定 DNA在elution後還好好地存在著
不曉得您實驗目的是什麼
但是既然要拿random fragement
何不先把這360 bp定個序? 然後找RE切位?
(反正定序才400元以內,記得附上PCR的primer)
: 但不知道為什麼 一切完之後再跑膠
: 我就什麼都看不到了....什麼band也沒有
: 我試了很多次 縮短反應時間 減低DNaseI的量
: 但還是都看不到
: 有可能是我DNA太少 切一切就看不到band
: 但我每一管大約都用700ng DNA去切
: 這樣是否還太少呢??
: 或想請問 還有什麼因素會導致我的東西都不見了呢??
: 這個星期都在做這個 卻一事無成
: 真擔心啊....還請各位提供一些建議!!
: 謝謝!!
你DNaseⅠ的量下多少阿？
作用溫度和反應時間呢?
小弟我直覺您的實驗出不來是因為DNA全部被幹光了
一般買到的酵素應該都是超濃縮的，所以效力應該超強!
--
才一個禮拜白工普普啦... 我之前做了整整一個月結果瞇挺時才發現一切是污染...-_-
從頭來 QQ
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標 題: Re: [問題] 請問DNaseI
發信站: 生生不息 (Sat Apr 30 16:32:58 2005)
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※ 引述《[email protected] (死胖子超怕熱)》之銘言：
> ※ 引述《[email protected] (World Peace)》之銘言：
> : 各位先進好
> : 想請教一個問題
> : 我最近在用DNaseI切一長度約 360bp的DNA PCR product
> : 想得到大小約 100bp的 random DNA fragments
> : 在treat DNaseI之前 我有先跑膠確定 DNA在elution後還好好地存在著
> 不曉得您實驗目的是什麼
> 但是既然要拿random fragement
> 何不先把這360 bp定個序? 然後找RE切位?
> (反正定序才400元以內,記得附上PCR的primer)
> : 但不知道為什麼 一切完之後再跑膠
> : 我就什麼都看不到了....什麼band也沒有
> : 我試了很多次 縮短反應時間 減低DNaseI的量
> : 但還是都看不到
> : 有可能是我DNA太少 切一切就看不到band
> : 但我每一管大約都用700ng DNA去切
> : 這樣是否還太少呢??
> : 或想請問 還有什麼因素會導致我的東西都不見了呢??
> : 這個星期都在做這個 卻一事無成
> : 真擔心啊....還請各位提供一些建議!!
> : 謝謝!!
> 你DNaseⅠ的量下多少阿？
> 作用溫度和反應時間呢?
> 小弟我直覺您的實驗出不來是因為DNA全部被幹光了
> 一般買到的酵素應該都是超濃縮的，所以效力應該超強!
請問 DNaseI 是切啥的?
我查網路 DNaseI 可以用來作 footprint analysis
http://binfo.ym.edu.tw/mb/pro_tc/footprint.htm
也就是說只有蛋白質保護的地方不會被切
那把 DNA 拿去切 當然全部切爛不是嗎?
為什麼要用到360bp 中的 random 100bp?
你的實驗有protocol 嗎 ? 可以Po 出 Protocol的來源嗎 ?
這種實驗時間縮再短 也得不到你要的效果吧?
--
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◣◢ Author: ubiquitin 從 61-218-73-118.HINET-IP.hinet.net 發表
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作者: ZecAhau (World Peace) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請問DNaseI
時間: Mon May 2 01:23:03 2005
※ 引述《[email protected] (goodday)》之銘言：
: ※ 引述《[email protected] (死胖子超怕熱)》之銘言：
: > 不曉得您實驗目的是什麼
: > 但是既然要拿random fragement
: > 何不先把這360 bp定個序? 然後找RE切位?
: > (反正定序才400元以內,記得附上PCR的primer)
: > 你DNaseⅠ的量下多少阿？
: > 作用溫度和反應時間呢?
: > 小弟我直覺您的實驗出不來是因為DNA全部被幹光了
: > 一般買到的酵素應該都是超濃縮的，所以效力應該超強!
: 請問 DNaseI 是切啥的?
: 我查網路 DNaseI 可以用來作 footprint analysis
: http://binfo.ym.edu.tw/mb/pro_tc/footprint.htm
: 也就是說只有蛋白質保護的地方不會被切
: 那把 DNA 拿去切 當然全部切爛不是嗎?
: 為什麼要用到360bp 中的 random 100bp?
: 你的實驗有protocol 嗎 ? 可以Po 出 Protocol的來源嗎 ?
: 這種實驗時間縮再短 也得不到你要的效果吧?
謝謝大大
其實我的實驗目的跟RNase protection是一樣的
我想找出蛋白質結合在RNA上特定的區段
我用的是SERF (In Vitro Selection of Random RNA Fragments)
Protocol是參照以下這篇paper
METHODS 25, 351-357 (2001)
SERF: In Vitro Selection of Random RNA Fragments to Identify Protein Binding
Sites within Large RNAs
以下是我用的condition
Reactive condition:
16 oC for 20~70min
50 mM Tris-HCl (pH8.0, 25oC)
0.01 mM MnCl2 (freshly prepared)
DNA (360bp) final conc. 35ng/μl
DNase I (RNase free) [Sigma] 0.3μg/μg DNA
Stop:
1mM EDTA 65oC, 10min
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※ 編輯: ZecAhau 來自: 140.109.224.35 (05/02 01:25)
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發信人: [email protected] (到頭來只是個墻外行人), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題] 請問DNaseI
發信站: 無名小站 (Mon May 2 15:01:38 2005)
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※ 引述《[email protected] (World Peace)》之銘言：
> ※ 引述《[email protected] (goodday)》之銘言：
> : 請問 DNaseI 是切啥的?
> : 我查網路 DNaseI 可以用來作 footprint analysis
> : http://binfo.ym.edu.tw/mb/pro_tc/footprint.htm
> : 也就是說只有蛋白質保護的地方不會被切
> : 那把 DNA 拿去切 當然全部切爛不是嗎?
> : 為什麼要用到360bp 中的 random 100bp?
> : 你的實驗有protocol 嗎 ? 可以Po 出 Protocol的來源嗎 ?
> : 這種實驗時間縮再短 也得不到你要的效果吧?
> 謝謝大大
> 其實我的實驗目的跟RNase protection是一樣的
> 我想找出蛋白質結合在RNA上特定的區段
> 我用的是SERF (In Vitro Selection of Random RNA Fragments)
> Protocol是參照以下這篇paper
> METHODS 25, 351-357 (2001)
> SERF: In Vitro Selection of Random RNA Fragments to Identify Protein Binding
> Sites within Large RNAs
> 以下是我用的condition
> Reactive condition:
> 16 oC for 20~70min
20~70這是你try的時間? 都不成?
> 50 mM Tris-HCl (pH8.0, 25oC)
> 0.01 mM MnCl2 (freshly prepared)
> DNA (360bp) final conc. 35ng/μl
你之前說每一管有700ng讓enzyme切不是嗎
你現在換更少量去做, 豈不是更糟糕
> DNase I (RNase free) [Sigma] 0.3μg/μg DNA
DNase I的activity是多少 1u/ug ?
我只有做過Trizol抽total RNA後RT前以DNase I處理我的sample (2~3ug toRNA)
(其中含多少DNA是不清楚啦)
30度C 30min就有很好的效果
以RT-PCR的結果來看, 看不到DNA contamination的產物
你參考的protocol有做到用DNase I切DNA嗎?
> Stop:
> 1mM EDTA 65oC, 10min
DNase I本來就是亂切DNA的endonuclease
而你確用DNase I在PCR product當中找出DNA binding protein的protection region
這會不會太奇怪了些
首先 (sorry, 我沒看你的reference)
你有沒有加你的protein下去讓它們與你的PCR product來個相見歡
就算有加你的protein, 你有沒有做cross linking
只有DNA 與 DNA polymerase, 就算加再多DNA也是白搭
我知到有人在做ChIP assay, 他們會用sonication的方法得到DNA fragments
好像是能弄到約一百多bp的東西
你要不要參考看看
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夫兵者不祥之器物或惡之故有道者不處君子居則貴左用兵則貴右兵者不祥之器非君子
之器不得已BBS telnet://bbs.wretch.cc 開個人板 超快 不用連署不可得志於天下
矣吉事尚左凶事尚右偏將軍居左上將軍居右言以喪禮處之殺人之眾以哀悲泣之戰勝以
喪禮處之道常無名樸雖小天下莫能臣侯王若能守之萬物將自賓天地相合以降甘露民莫
之令而自均始制有名名亦既有夫亦將知止知止可以不殆譬道之在天 140.109.40.39海
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發信人: [email protected] (到頭來只是個墻外行人), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題] 請問DNaseI
發信站: 無名小站 (Mon May 2 15:04:08 2005)
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※ 引述《gilchang (到頭來只是個墻外行人)》之銘言：
> > DNA (360bp) final conc. 35ng/μl
> 你之前說每一管有700ng讓enzyme切不是嗎
> 你現在換更少量去做, 豈不是更糟糕
對不起, 這是我沒看清楚....
所以你的final volume是20ul?
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夫兵者不祥之器物或惡之故有道者不處君子居則貴左用兵則貴右兵者不祥之器非君子
之器不得已BBS telnet://bbs.wretch.cc 開個人板 超快 不用連署不可得志於天下
矣吉事尚左凶事尚右偏將軍居左上將軍居右言以喪禮處之殺人之眾以哀悲泣之戰勝以
喪禮處之道常無名樸雖小天下莫能臣侯王若能守之萬物將自賓天地相合以降甘露民莫
之令而自均始制有名名亦既有夫亦將知止知止可以不殆譬道之在天 140.109.40.39海