推 enisx:多了的那個是不是A ?? 會否是因為Taq 的性質所造成 140.112.5.61 09/02
推 kellytsai:恩..不是~應該是設錯了 218.168.5.135 09/03
推 ROKEE:給1樓，一般轉pET不建議直接拿PCR產物接喔~~ XDDD 218.162.85.68 09/03
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作者: ROKEE (..) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請問幾個問題!
時間: Fri Sep 2 23:33:26 2005
※ 引述《kellytsai (太過??)》之銘言：
: 當時在設primer時
: 限制脢的切位和對應出的aa序列好像出問題了
: 就是接上vector後
: 前面的切位正確!!
: 所以我的insert所對應的aa都沒錯
: 不過後面的切位好像多了一個核甘應該會造成shift!!
: 我本來想用 pET29a 上的 Bgl II 及 Hind III 兩個切點
: 照理說 後面應該接了一堆 Pro 然後有終止密碼
: shift後應該會對應到 pET29c
不太懂你意思ㄝ..
原本用pET29a然後接進去會變成pET29c？？？
那你有確定從start 捯摯n開始算的話您想表現的protein有in frame嗎?
: 變成一堆 Thr 而且也看不見終止序列
: 但是今天induce 重組蛋白表現有明顯的產物
: 問題來啦!!
: 1.請問要如何預估我產物蛋白大小呢?
: 我的insert約630
: 跑出的band為28kd
: 這樣是對的嗎??
DNA= 630 bp
so, (630/3)x110 = 23.1 kD
恩... 我不知道您跑出來28kD算不算是在誤差範圍內XDD
可能要請版上高手們指點一下^^"
: 2.shift後變成 Thr !!
: 那還能用同樣的方法純化嗎?
你原來是想用什麼方式純化呢?
一般會用pET系統多半是想利用上面帶的N-ter或C-ter Hisx6的tag進行純化
這樣大多數情況下用桌上型的His tag column就行了
當然，純化蛋白方法很多
只要你有機器、有藥品，幾乎什麼樣的蛋白都能夠純化出來的
就算是不帶任何tag也可以
: 困惑啊啊啊啊!!!!!
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◆ From: 140.120.213.101
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作者: kellytsai (太過??) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請問幾個問題!
時間: Sat Sep 3 00:49:39 2005
※ 引述《ROKEE (..)》之銘言：
: ※ 引述《kellytsai (太過??)》之銘言：
: 不太懂你意思ㄝ..
: 原本用pET29a然後接進去會變成pET29c？？？
因為要用兩個限制脢接進去
前面有in frame 但後面設的限制脢切點沒對好~
所以後面有frame shift 變成 pET29c 的後面那段
: 那你有確定從start 捯摯n開始算的話您想表現的protein有in frame嗎?
: : 變成一堆 Thr 而且也看不見終止序列
: : 但是今天induce 重組蛋白表現有明顯的產物
: : 問題來啦!!
: : 1.請問要如何預估我產物蛋白大小呢?
: : 我的insert約630
: : 跑出的band為28kd
: : 這樣是對的嗎??
: DNA= 630 bp
: so, (630/3)x110 = 23.1 kD
: 恩... 我不知道您跑出來28kD算不算是在誤差範圍內XDD
: 可能要請版上高手們指點一下^^"
哇~"~..那好像差的有點多..
: : 2.shift後變成 Thr !!
: : 那還能用同樣的方法純化嗎?
: 你原來是想用什麼方式純化呢?
原本想用His-tag純化
不知道變 Thr 還可不可以用這個方法
: : 困惑啊啊啊啊!!!!!
謝謝你歐~~
不知道是不是要換算一下蛋白質的PI`~`
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我的相簿歐*^____^*
http://www.wretch.cc/album/pikmin
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作者: ROKEE (..) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請問幾個問題!
時間: Sat Sep 3 01:46:03 2005
※ 引述《kellytsai (太過??)》之銘言：
: ※ 引述《ROKEE (..)》之銘言：
: : 不太懂你意思ㄝ..
: : 原本用pET29a然後接進去會變成pET29c？？？
: 因為要用兩個限制脢接進去
: 前面有in frame 但後面設的限制脢切點沒對好~
: 所以後面有frame shift 變成 pET29c 的後面那段
最快的解決方是就是重新設計3'的primer
: : 那你有確定從start 捯摯n開始算的話您想表現的protein有in frame嗎?
: : DNA= 630 bp
: : so, (630/3)x110 = 23.1 kD
: : 恩... 我不知道您跑出來28kD算不算是在誤差範圍內XDD
: : 可能要請版上高手們指點一下^^"
: 哇~"~..那好像差的有點多..
: : 你原來是想用什麼方式純化呢?
: 原本想用His-tag純化
: 不知道變 Thr 還可不可以用這個方法
沒有路......
: 謝謝你歐~~
: 不知道是不是要換算一下蛋白質的PI`~`
predict pI值很多網站都可以做，丟你的a.a. seq就可以了
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