推 apa9394:I agree with your point of view.... 10/19 14:42
請問…有人用過IRES-GFP的plasmid嗎?
想問的問題是…當 設計一個IRES-GFP前面插入gene的plasmid
與vector only的control 的transfection
作比較時，往往我的GFP亮度表現是：vector only的亮度大於IRES前面有插入gene
的plasmid的亮度，約有五到十倍以上的差距吧…不管亮度或是有發亮的細胞數
能想到的原因為：
1。plasmid變較大 導致trnasfection的效率下降。
2。IRES 前面插了gene，使得ribosome比較難從IRES上去做translation。
請問：1。是否有paper或是實驗說明這兩個原因成立?
或是有人有相同經驗或是不同的經驗?
2。還有什麼原因會造成這樣子的結果?
附註：vector為pIRES-hrGFP(stratagene)5.5kb
insert為2.3kb
cell為HeLa或是293
transfection的方法為lipofectamine
--
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作者: apa9394 (apa) 看板: Biotech
標題: Re: [問題]IRES-GFP
時間: Fri Oct 14 15:21:14 2005
※ 引述《isuy ()》之銘言：
: 請問…有人用過IRES-GFP的plasmid嗎?
: 想問的問題是…當 設計一個IRES-GFP前面插入gene的plasmid
: 與vector only的control 的transfection
: 作比較時，往往我的GFP亮度表現是：vector only的亮度大於IRES前面有插入gene
: 的plasmid的亮度，約有五到十倍以上的差距吧…不管亮度或是有發亮的細胞數
: 能想到的原因為：
: 1。plasmid變較大 導致trnasfection的效率下降。
: 2。IRES 前面插了gene，使得ribosome比較難從IRES上去做translation。
: 請問：1。是否有paper或是實驗說明這兩個原因成立?
: 或是有人有相同經驗或是不同的經驗?
我是在做stratagene其他的plasmid(ap-1-luc,nf-kb-luc plasmid)
就根據你的結果和我的經驗
1.我覺得這個assay transfection efficiency是一個問題
a.因為每種細胞uptake都不盡相同(我是HepG2>RAW264.1>HSCT6...)
b.那個你insert進去的那個片段和相對應的protein
能先用電泳看DNA-protein interaction嗎?(可能要做isotope,對你的plasmid做isotope)
2.送進去的plasmid 從transcription 到translation的ratio應該也不太ㄧ樣吧
3.你選的cell line會不會有此gene的endogenous inactivator
or inhibitor for your candidate gene?
4.trasfection方法還有很多,用電的...或是用其他家的transfection reagent
eg. roche fugene 6...
: 2。還有什麼原因會造成這樣子的結果?
: 附註：vector為pIRES-hrGFP(stratagene)5.5kb
: insert為2.3kb
: cell為HeLa或是293
: transfection的方法為lipofectamine
最後...隔cell如隔山...
不同cell實驗條件會差很多喔...
加油...參考參考....
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注音文，實際上叫做分散式阻斷中文攻擊（Distributed Denial of Chinese）
定義：攻擊者利用某種發音符號參雜在文句之中，使其閱讀困難，
稱為阻斷中文攻擊（Denial of Chinese），簡稱 DoC。
而使整篇文章充滿非中文的發音符號，則稱為分散式阻斷中文攻擊，
簡稱 DDoC。
範例：http://home.anet.net.tw/aa013797/
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發信人: [email protected] (到頭來只是個墻外行人), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題]IRES-GFP
發信站: 無名小站 (Sat Oct 15 17:56:09 2005)
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※ 引述《[email protected]》之銘言：
> 請問…有人用過IRES-GFP的plasmid嗎?
> 想問的問題是…當 設計一個IRES-GFP前面插入gene的plasmid
> 與vector only的control 的transfection
> 作比較時，往往我的GFP亮度表現是：vector only的亮度大於IRES前面有插入gene
> 的plasmid的亮度，約有五到十倍以上的差距吧…不管亮度或是有發亮的細胞數
> 能想到的原因為：
> 1。plasmid變較大 導致trnasfection的效率下降。
> 2。IRES 前面插了gene，使得ribosome比較難從IRES上去做translation。
> 請問：1。是否有paper或是實驗說明這兩個原因成立?
> 或是有人有相同經驗或是不同的經驗?
> 2。還有什麼原因會造成這樣子的結果?
> 附註：vector為pIRES-hrGFP(stratagene)5.5kb
> insert為2.3kb
> cell為HeLa或是293
> transfection的方法為lipofectamine
只是做transfection
沒有做其他處理嗎?
我是說像是加點神油什麼的讓IRES表現, 而cap-dep.不作用....
能不能再詳細說明你的方法
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夫兵者不祥之器物或惡之故有道者不處君子居則貴左用兵則貴右兵者不祥之器非君子
之器不得已而用之恬淡為上勝而不美而美之者是樂殺人夫樂殺人者則不可得志於天下
矣吉事尚左凶事尚右偏將軍居左上將軍居右言以喪禮處之殺人之眾以哀悲泣之戰勝以
喪禮處之道常無名樸雖小天下莫能臣侯王若能守之萬物將自賓天地相合以降甘露民莫
之令而自均始制有名名亦既有夫亦將知止知 218-167-240-233.dynamic.hinet.net海
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作者: hal (Acer NB 使用中...) 站內: Biotech
標題: Re: [問題]IRES-GFP
時間: Sat Oct 15 20:56:49 2005
※ 引述《isuy ()》之銘言：
: 請問…有人用過IRES-GFP的plasmid嗎?
: 想問的問題是…當 設計一個IRES-GFP前面插入gene的plasmid
: 與vector only的control 的transfection
: 作比較時，往往我的GFP亮度表現是：vector only的亮度大於IRES前面有插入gene
: 的plasmid的亮度，約有五到十倍以上的差距吧…不管亮度或是有發亮的細胞數
: 能想到的原因為：
: 1。plasmid變較大 導致trnasfection的效率下降。
這個也是有可能的因素
: 2。IRES 前面插了gene，使得ribosome比較難從IRES上去做translation。
: 請問：1。是否有paper或是實驗說明這兩個原因成立?
: 或是有人有相同經驗或是不同的經驗?
: 2。還有什麼原因會造成這樣子的結果?
: 附註：vector為pIRES-hrGFP(stratagene)5.5kb
: insert為2.3kb
: cell為HeLa或是293
我們實驗室有三個不同大小insert gene
700bp 1400bp 2100bp
transfection(lipofectamine)後這三個GFP的亮度為700>1400>2100
所以便覺得很奇怪
cell也是好transfection的293T
不過在做western 時protein的表現還算不錯
大致上量差不了太多
: transfection的方法為lipofectamine
因此學長姊覺得可能會不會mRNA太長了導致ires部分的二級結構有影響
進而導致GFP的表現受到影響
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作者: isuy () 看板: Biotech
標題: Re: [問題]IRES-GFP
時間: Sun Oct 16 19:05:06 2005
※ 引述《[email protected] (到頭來只是個墻外行人)》之銘言：
: ※ 引述《[email protected]》之銘言：
: > 請問…有人用過IRES-GFP的plasmid嗎?
: > 想問的問題是…當 設計一個IRES-GFP前面插入gene的plasmid
: > 與vector only的control 的transfection
: > 作比較時，往往我的GFP亮度表現是：vector only的亮度大於IRES前面有插入gene
: > 的plasmid的亮度，約有五到十倍以上的差距吧…不管亮度或是有發亮的細胞數
: > 能想到的原因為：
: > 1。plasmid變較大 導致trnasfection的效率下降。
: > 2。IRES 前面插了gene，使得ribosome比較難從IRES上去做translation。
: > 請問：1。是否有paper或是實驗說明這兩個原因成立?
: > 或是有人有相同經驗或是不同的經驗?
: > 2。還有什麼原因會造成這樣子的結果?
: > 附註：vector為pIRES-hrGFP(stratagene)5.5kb
: > insert為2.3kb
: > cell為HeLa或是293
: > transfection的方法為lipofectamine
: 只是做transfection
: 沒有做其他處理嗎?
: 我是說像是加點神油什麼的讓IRES表現, 而cap-dep.不作用....
: 能不能再詳細說明你的方法
只有作transfection而已 然後利用GFP看他的efficiency
然後作western blot看蛋白量的表現…因為western blot看不到
再加上GFP亮度有差所以才在想是否因為
1) transfection的efficiency太差導致看不到蛋白(由GFP判斷efficiency)
2) transfection的efficiency不會變差，只是因為GFP前面有加gene的關系
使得GFP表現量降低，western bolt蛋白看不見的原因可能有其它因素(
像是plasmid不好或是這蛋白本身就難表現)
3) 以上綜合。
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◆ From: 140.112.133.163
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作者: isuy () 看板: Biotech
標題: Re: [問題]IRES-GFP
時間: Sun Oct 16 19:07:22 2005
※ 引述《hal (Acer NB 使用中...)》之銘言：
: ※ 引述《isuy ()》之銘言：
: : 請問…有人用過IRES-GFP的plasmid嗎?
: : 想問的問題是…當 設計一個IRES-GFP前面插入gene的plasmid
: : 與vector only的control 的transfection
: : 作比較時，往往我的GFP亮度表現是：vector only的亮度大於IRES前面有插入gene
: : 的plasmid的亮度，約有五到十倍以上的差距吧…不管亮度或是有發亮的細胞數
: : 能想到的原因為：
: : 1。plasmid變較大 導致trnasfection的效率下降。
: 這個也是有可能的因素
: : 2。IRES 前面插了gene，使得ribosome比較難從IRES上去做translation。
: : 請問：1。是否有paper或是實驗說明這兩個原因成立?
: : 或是有人有相同經驗或是不同的經驗?
: : 2。還有什麼原因會造成這樣子的結果?
: : 附註：vector為pIRES-hrGFP(stratagene)5.5kb
: : insert為2.3kb
: : cell為HeLa或是293
: 我們實驗室有三個不同大小insert gene
: 700bp 1400bp 2100bp
: transfection(lipofectamine)後這三個GFP的亮度為700>1400>2100
: 所以便覺得很奇怪
: cell也是好transfection的293T
: 不過在做western 時protein的表現還算不錯
: 大致上量差不了太多
: : transfection的方法為lipofectamine
: 因此學長姊覺得可能會不會mRNA太長了導致ires部分的二級結構有影響
: 進而導致GFP的表現受到影響
感謝…這數據有很好的參考價值…
我來試試看不同size的DNA是否會有影響好了~
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◆ From: 140.112.133.163
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作者: isuy () 看板: Biotech
標題: Re: [問題]IRES-GFP
時間: Sun Oct 16 19:15:56 2005
※ 引述《apa9394 (apa)》之銘言：
: ※ 引述《isuy ()》之銘言：
: : 請問…有人用過IRES-GFP的plasmid嗎?
: : 想問的問題是…當 設計一個IRES-GFP前面插入gene的plasmid
: : 與vector only的control 的transfection
: : 作比較時，往往我的GFP亮度表現是：vector only的亮度大於IRES前面有插入gene
: : 的plasmid的亮度，約有五到十倍以上的差距吧…不管亮度或是有發亮的細胞數
: : 能想到的原因為：
: : 1。plasmid變較大 導致trnasfection的效率下降。
: : 2。IRES 前面插了gene，使得ribosome比較難從IRES上去做translation。
: : 請問：1。是否有paper或是實驗說明這兩個原因成立?
: : 或是有人有相同經驗或是不同的經驗?
: 我是在做stratagene其他的plasmid(ap-1-luc,nf-kb-luc plasmid)
: 就根據你的結果和我的經驗
: 1.我覺得這個assay transfection efficiency是一個問題
: a.因為每種細胞uptake都不盡相同(我是HepG2>RAW264.1>HSCT6...)
我是觀察同一種細胞 transfect vector only及有表現我要的gene的plasmid
的GFP亮度有差異。
: b.那個你insert進去的那個片段和相對應的protein
: 能先用電泳看DNA-protein interaction嗎?(可能要做isotope,對你的plasmid做isotope)
: 2.送進去的plasmid 從transcription 到translation的ratio應該也不太ㄧ樣吧
: 3.你選的cell line會不會有此gene的endogenous inactivator
: or inhibitor for your candidate gene?
這點的確值的考濾，我會再查查看 是不是這個因素
不過我利用同樣的plasmid有挑到stable clone
所以會想到有沒有可能是因為transient transfection讓細胞在一定時間內
表現出大量的蛋白，如果這蛋白太高量的話會影響到細胞甚至讓他死亡
而挑出的stable clone是挑到能接受此蛋白的表現量的細胞
: 4.trasfection方法還有很多,用電的...或是用其他家的transfection reagent
: eg. roche fugene 6...
: : 2。還有什麼原因會造成這樣子的結果?
: : 附註：vector為pIRES-hrGFP(stratagene)5.5kb
: : insert為2.3kb
: : cell為HeLa或是293
: : transfection的方法為lipofectamine
: 最後...隔cell如隔山...
: 不同cell實驗條件會差很多喔...
: 加油...參考參考....
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