※ 引述《cmnhobert (QQ水熊)》之銘言：
: ※ 引述《Anemos (寶寶)》之銘言：
: : 請問在做RT時
: : 我們會在第一步加入的 Oligo dT 的作用是什麼?
: 黏到RNA的5`端poly A tail上
: 之後酵素才能開始作cDNA
比較嚴謹的做法是再加一條和你的target gene pairing的oligo
確保你所要的片段更能夠在PCR時被P到
甚至還有更變態的 =>
直接用PCR primer丟下去XD
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遨遊崑崙上空 俯瞰太平洋濱
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◆ From: 203.69.64.83
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作者 aggaci (五子棋啦) 看板 Biotech
標題 Re: [問題] 請問做RNA轉cDNA
時間 Sat Oct 16 22:22:30 2004
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※ 引述《Bcl2 (Ode to Joy)》之銘言：
: ※ 引述《cmnhobert (QQ水熊)》之銘言：
: : 黏到RNA的5`端poly A tail上
: : 之後酵素才能開始作cDNA
: 更嚴謹的做法是再加一條和你的target gene pairing的oligo
: 確保你所要的片段更能夠在PCR時被P到
: 甚至還有更變態的 =>
: 直接用PCR primer丟下去
我是這麼做的...直接用reverse primer作RT
有好處也有壞處
因我做real time pcr要看的基因表現量很低
所以做rt時 RNA加到10甚至20 ug
以reverse primer做....就有了....只是就不能看其他基因....
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作者 Anemos (寶寶) 看板 Biotech
標題 Re: [問題] 請問做RNA轉cDNA
時間 Sat Oct 16 23:29:22 2004
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※ 引述《aggaci (五子棋啦)》之銘言：
: ※ 引述《Bcl2 (Ode to Joy)》之銘言：
: : 更嚴謹的做法是再加一條和你的target gene pairing的oligo
: : 確保你所要的片段更能夠在PCR時被P到
: : 甚至還有更變態的 =>
: : 直接用PCR primer丟下去
: 我是這麼做的...直接用reverse primer作RT
: 有好處也有壞處
: 因我做real time pcr要看的基因表現量很低
: 所以做rt時 RNA加到10甚至20 ug
: 以reverse primer做....就有了....只是就不能看其他基因....
嗯 謝謝
因為我需要看的不只一種gene
所以得用oligo dT去做
還有一個問題想請問(唉...學不精...)
請問RT做完以後的product
是雙股還是單股
如果是雙股的話
是怎麼樣的雙股?
AATTATGGCATG or AATTATGGCATG
TTAATACCGTAC UUAAUACCGUAC
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作者 Anemos (寶寶) 看板 Biotech
標題 Re: [問題] 請問做RNA轉cDNA
時間 Sun Oct 17 01:45:37 2004
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: 是雙股
: 看你加的dNTP是哪種
: 如果是dT的產物就是左邊 如果是dU的就是右邊
那會不會有這一種? AAUUAUGGCAUG
UUAAUACCGUAC
應該這麼問 RT完的product是雙股的話
那它兩股的來源 是不是一股來自RNA 但原本的核醣核酸被酵素作用成去氧核醣核酸
而另一股則是 由dNTP為材料直接合成互補序列出來
還是說 它的一股還是維持是RNA 只是合成另一股互補的DNA?
因為RT的過程會經過幾次高溫 所以才會想 在過程中RNA會不會被破壞掉? 或留到最後?
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作者 aggaci (五子棋啦) 看板 Biotech
標題 Re: [問題] 請問做RNA轉cDNA
時間 Wed Oct 20 13:28:49 2004
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: 請問RT做完以後的product
: 是雙股還是單股
: 如果是雙股的話
: 是怎麼樣的雙股?
: AATTATGGCATG or AATTATGGCATG
: TTAATACCGTAC UUAAUACCGUAC
要看enzyme的特性
最普通的RTase是只作單股.....
若是須傲可以作雙股的RTase會貴很多
但若只是單純的作RT-PCR 第一種即可
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