推 blence:會先transfer到membrane，在利用30min的 61.31.148.81 11/28
→ blence:prehybridization洗掉,不過不保證要洗乾淨 61.31.148.81 11/28
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作者 aggaci (五子棋啦) 看板 Biotech
標題 Re: [問題] Northern : Etbr
時間 Sun Nov 28 14:06:56 2004
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※ 引述《HIbaby (嗨北鼻)》之銘言：
: 關於Northern
: 大家會用Etbr去染28s/18s 嗎?
: 如果用Etbr去染
: 有人說會影響後面的敏銳度
: 不知道影響有多大?
: 還是在做後面步驟時 會先洗過gel 在去transfer?
你在destain時應該就算是wash了吧?
因我都有wash..所以到是沒啥影響
不過我很久沒做了 現在都是作real time PCR....
isotope太危險麻煩了啦!
--
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◆ From: 140.114.100.165
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作者 tracy9102 (舞飛櫻) 看板 Biotech
標題 Re: [問題] Northern : Etbr
時間 Sun Nov 28 18:34:57 2004
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※ 引述《aggaci (五子棋啦)》之銘言：
: ※ 引述《HIbaby (嗨北鼻)》之銘言：
: : 關於Northern
: : 大家會用Etbr去染28s/18s 嗎?
: : 如果用Etbr去染
: : 有人說會影響後面的敏銳度
: : 不知道影響有多大?
: : 還是在做後面步驟時 會先洗過gel 在去transfer?
: 你在destain時應該就算是wash了吧?
: 因我都有wash..所以到是沒啥影響
: 不過我很久沒做了 現在都是作real time PCR....
: isotope太危險麻煩了啦!
RT PCR的敏感性太高
意思是做10次可能10次結果都不太相同
用isotope效果好
而且若要在國際期刊發表的話
也比RT PCR的成果還要值得採信
提供參考 ^^
--
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◆ From: 61.64.4.23
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作者 iFann (月姬) 看板 Biotech
標題 Re: [問題] Northern : Etbr
時間 Sun Nov 28 19:16:03 2004
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※ 引述《tracy9102 (舞飛櫻)》之銘言：
: ※ 引述《aggaci (五子棋啦)》之銘言：
: : 你在destain時應該就算是wash了吧?
: : 因我都有wash..所以到是沒啥影響
: : 不過我很久沒做了 現在都是作real time PCR....
: : isotope太危險麻煩了啦!
: RT PCR的敏感性太高
: 意思是做10次可能10次結果都不太相同
: 用isotope效果好
: 而且若要在國際期刊發表的話
: 也比RT PCR的成果還要值得採信
: 提供參考 ^^
RealTime請跟RT PCR分清楚
是不一樣的東西啊
RealTime好像有個簡稱是Q PCR(Quantitative)
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◆ From: 140.113.185.35
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作者 HIbaby (嗨北鼻) 看板 Biotech
標題 Re: [問題] Northern : Etbr
時間 Sun Nov 28 19:22:15 2004
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※ 引述《iFann (月姬)》之銘言：
: ※ 引述《tracy9102 (舞飛櫻)》之銘言：
: : RT PCR的敏感性太高
: : 意思是做10次可能10次結果都不太相同
: : 用isotope效果好
: : 而且若要在國際期刊發表的話
: : 也比RT PCR的成果還要值得採信
: : 提供參考 ^^
: RealTime請跟RT PCR分清楚
: 是不一樣的東西啊
: RealTime好像有個簡稱是Q PCR(Quantitative)
在 realtime PCR 中 同樣會面臨到primer好不好黏的問題?
這樣會不會也影響數據的可靠性?
帶我實驗的人 他非常不相信RT-pcr來的數據 Orz
呵呵
--
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◆ From: 219.1.156.27
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作者 aggaci (五子棋啦) 看板 Biotech
標題 Re: [問題] Northern : Etbr
時間 Sun Nov 28 19:31:39 2004
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※ 引述《tracy9102 (舞飛櫻)》之銘言：
: ※ 引述《aggaci (五子棋啦)》之銘言：
: : 你在destain時應該就算是wash了吧?
: : 因我都有wash..所以到是沒啥影響
: : 不過我很久沒做了 現在都是作real time PCR....
: : isotope太危險麻煩了啦!
: RT PCR的敏感性太高
: 意思是做10次可能10次結果都不太相同
: 用isotope效果好
: 而且若要在國際期刊發表的話
: 也比RT PCR的成果還要值得採信
: 提供參考 ^^
基本上 real time PCR 不等於 RT-PCR
RT-PCR的RT是reverse transcription 並非 Real time
但是原理跟RT-PCR雷同
and 你忽略一點
基本上我看的paper 10篇有半數以上都採用real time PCR而不用Northern blot
這個絕對是趨勢
為什麼?舉個例子好了
若是我想看的2個基因 她們的相似度高達85%以上
你要如何用Northern blot分辨出她們??
而Northern blot一次只能看一個基因
你要看第二個 要洗掉再重新hybridize
這樣一個禮拜就過去了 若是還有第三第四個基因勒?? 那得花多少時間
而realtime PCR沒有這些問題
它可以從primer, probe上動手腳
即使你要看的基因相似度很高 仍然可以分辨出來(我的實驗就是如此)
而我們lab一次看3~5個基因是常有的事
從抽RNA=>Reverse transcription=>上機=>analyse data
拼一點 一天完成 ok 那不拼好了 兩天 那混一點好了 三天
照樣把northern blot打的死死的!
以前我碩二趕論文 一個禮拜 就用realtime pcr三重複做出來
若是用northern blot呢?該花多久時間
還得擔心isotope 麻煩死了!
說真的啦 real time pcr唯一輸northern blot的地方就只有價錢啦
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◆ From: 140.114.100.165
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作者 aggaci (五子棋啦) 看板 Biotech
標題 Re: [問題] Northern : Etbr
時間 Sun Nov 28 19:32:35 2004
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※ 引述《HIbaby (嗨北鼻)》之銘言：
: ※ 引述《iFann (月姬)》之銘言：
: : RealTime請跟RT PCR分清楚
: : 是不一樣的東西啊
: : RealTime好像有個簡稱是Q PCR(Quantitative)
: 在 realtime PCR 中 同樣會面臨到primer好不好黏的問題?
: 這樣會不會也影響數據的可靠性?
: 帶我實驗的人 他非常不相信RT-pcr來的數據 Orz
: 呵呵
基本上RT-PCR只能看有沒有摟....
沒人會用它來比較基因表現量吧...
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◆ From: 140.114.100.165
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作者 aggaci (五子棋啦) 看板 Biotech
標題 Re: [問題] Northern : Etbr
時間 Sun Nov 28 19:49:03 2004
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※ 引述《HIbaby (嗨北鼻)》之銘言：
: ※ 引述《iFann (月姬)》之銘言：
: : RealTime請跟RT PCR分清楚
: : 是不一樣的東西啊
: : RealTime好像有個簡稱是Q PCR(Quantitative)
: 在 realtime PCR 中 同樣會面臨到primer好不好黏的問題?
: 這樣會不會也影響數據的可靠性?
喔對 突然想到
好不好黏 這個基本上只要P的出來且產物專一,無primer dimer
我就認為他是可以work的
而進行real time pcr端看你是用哪一種方式
如SYBR green or Taqman probe??
我是用SYBR green啦 Taqman probe太貴了!
我用的那種分成relative quatification & absolute qutification
若是用absolute qutification 得作一條standard curve
用內差法算出你RNA的量, 此法較花錢但比較準
relative quatification事先算出primer進行PCR時的efficiency
再透過一堆數學公式去算出相對量, 此法較省但誤差較大
那個real time pcr我個人覺得loading的技巧非常重要啦
至於會不會影響到數據可靠性 三重複做出來有明顯差距就是有啦~~
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◆ From: 140.114.100.165
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作者 gilchang.bbs@bbs.wretch.cc (也是老外), 看板 Biotech
標題 Re: Northern : Etbr
時間 無名小站 (Wed Dec 1 02:40:02 2004)
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※ 引述《HIbaby.bbs@ptt.cc (嗨北鼻)》之銘言：
> 關於Northern
> 大家會用Etbr去染28s/18s 嗎?
> 如果用Etbr去染
> 有人說會影響後面的敏銳度
> 不知道影響有多大?
> 還是在做後面步驟時 會先洗過gel 在去transfer?
1. 會
2. 分開操作就不會有影響啦，何必將你要hybridize的RNA 也染上EtBr呢?
EtBr會嵌入核酸當中, 要把它弄下來還得用butyric acid(?忘了)洗才行。
3. 18S, 28S的那一塊gel你可以弄去染EtBr，另外的就做Northern去。
--
夫兵者不祥之器物或惡之故有道者不處君子居則貴左用兵則貴右兵者不祥之器非君子
之器不得已BBS telnet://bbs.wretch.cc 開個人板 超快 不用連署不可得志於天下
矣吉事尚左凶事尚右偏將軍居左上將軍居右言以喪禮處之殺人之眾以哀悲泣之戰勝以
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之令而自均始制有名名亦既有夫亦將知止知止 218-167-7-119.dynamic.hinet.net海
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作者 aggaci (五子棋啦) 看板 Biotech
標題 Re: Northern : Etbr
時間 Wed Dec 1 18:01:19 2004
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※ 引述《gilchang.bbs@bbs.wretch.cc (也是老外)》之銘言：
: ※ 引述《HIbaby.bbs@ptt.cc (嗨北鼻)》之銘言：
: > 關於Northern
: > 大家會用Etbr去染28s/18s 嗎?
: > 如果用Etbr去染
: > 有人說會影響後面的敏銳度
: > 不知道影響有多大?
: > 還是在做後面步驟時 會先洗過gel 在去transfer?
: 1. 會
: 2. 分開操作就不會有影響啦，何必將你要hybridize的RNA 也染上EtBr呢?
: EtBr會嵌入核酸當中, 要把它弄下來還得用butyric acid(?忘了)洗才行。
: 3. 18S, 28S的那一塊gel你可以弄去染EtBr，另外的就做Northern去。
但是那如果好死不死 你要hybrizye的那片gel的RNAdegrade了勒
很不保險
我以前是先染EtBr 退染之後再transfer...
一樣做的嚇嚇叫
但我是用isotope啦
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→ aggaci:對了 我退染只用普通水 140.114.100.165 12/01