推 aggaci:唉 幫不了你,沒用過Dig.... 140.114.100.165 11/28
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作者 key () 看板 Biotech
標題 Re: [問題]請問有關northern blot
時間 Sun Nov 28 21:39:58 2004
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略列幾個考量點 :
1.hypridization temp and/or duration 可調整
我通常overnight 我probe長 也要求專一 所以溫度也會較高
2.probe conc.
過濃 有可能出現全黑 過稀 可能全無
3.dose your target gene expression?
也許真的沒有表現....... 有沒有RT-PCR先試過再作
改條件 多試試 大家的condition不盡相同
多嘗試一定會成功的 加油^^
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◆ From: 219.84.20.245
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作者 HIbaby (嗨北鼻) 看板 Biotech
標題 Re: [問題]請問有關northern blot
時間 Sun Nov 28 22:43:08 2004
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※ 引述《titan50463 (哈)》之銘言：
: 首先
: 電永 是用MOPS的BUFFER跑電永 約6*6CM (GEL) 那種電永槽 100V 40MIN
: (我會先跑一次利用EtBr染色 確定28S和18S都完整 沒有degradation
: ps. RNA sample loading量約30micro-gram )
: transfer 是利用20x SSC buffer 約20小時 (用平板衛生紙一大包)
: (我會再利用EtBr來確定transfer情形,大致上都還好,會有一些還沒有完全
: transfer)
我不會那麼久 約隔夜 早上就收了 大概十二小時吧
: prehybridization 是用 ambion的 ULTRAhybr 7ml 42度下 搖30min
我是自己配的ｈｉｇｈｓｄｓ buffer 42度 四小時
: hybridization 是直接加入probe(cDNA 約280 bp) 約30ng/ml 42度下 搖 4hr
這邊我拉比較久 約八小時以上
: (probe我是用roche的kit做的,kit有教test probe efficiency
: 結果都還可以)
: 利用2x SSPE+1%SDS wash twice, 室溫 5min
: 利用0.1x SSPE+1%SDS wash twice,室溫 15min
這邊我是在約 六十度下 兩次 各十五分鐘
: detection 主要是參考roche的kit做的
我跟你用相同的套組
: 利用dig-wash buffer 5min,室溫
: blocking solution 1hr,室溫 (這也是kit內附的)
: blocking solution containg anti-digoxigenin-alkaline phosphate
: conjugate 1hr,室溫
: dig-wash buffer twice,15min 室溫
這一步 我都是超激烈搖洗 因為背景殖才會降低 可以到相當乾淨
: 最近一次還看到RNA電永的痕跡 是表示我的RNA degradation了嗎
基本上rna 在膠內 就挺安全的了 況且你 transferc 後 還有檢查
我想也許你在loading 前 RNA 就掛了也說不一定
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PTT 統合生命科學研究院
Biotech 生物醫學研究所 幹細胞研究室
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◆ From: 219.1.156.27
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作者 chaowilliam (實習好忙喔>< 看板 Biotech
標題 Re: [問題]請問有關northern blot
時間 Sun Nov 28 23:15:56 2004
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※ 引述《titan50463 (哈)》之銘言：
: 我已經嘗試很多次了
: 但都不成功
: 想請問一下我的做法是否有問題
: 最近一次還看到RNA電永的痕跡 是表示我的RNA degradation了嗎
根據我的經驗
有這樣的痕跡往往是gel還沒完全硬就下去跑電泳
才會有拖一條長長的痕跡
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◆ From: 218.166.212.202
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作者 csmceddie (eddie) 看板 Biotech
標題 Re: [問題]請問有關northern blot
時間 Sun Nov 28 23:54:13 2004
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※ 引述《titan50463 (哈)》之銘言：
: 我已經嘗試很多次了
: 但都不成功
: 想請問一下我的做法是否有問題
: 首先
: 電永 是用MOPS的BUFFER跑電永 約6*6CM (GEL) 那種電永槽 100V 40MIN
: (我會先跑一次利用EtBr染色 確定28S和18S都完整 沒有degradation
: ps. RNA sample loading量約30micro-gram )
如果我沒記錯的話 用Roche DIG system做Northern
他是說RNA的量不要超過5 micro-gram
(太多會做不出來或是像你看到的RNA電泳的痕跡)
還有我在做的時候我不會加EtBr在膠裡面
(聽說會影響到hybridization但影響有多大我不清楚)
還有就是你要確定你所有用的buffer都要是DEPC treated
也就是都要確定沒有RNase
按照Roche的protocol hybridization是放O.N.
4小時會不會太短了一點
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◆ From: 61.229.122.48
推 chaowilliam:說明書上是說至少要hyb 8hr以上 218.166.212.202 11/29
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作者 csmceddie (eddie) 看板 Biotech
標題 Re: [問題]請問有關northern blot
時間 Sun Nov 28 23:58:06 2004
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※ 引述《aggaci (五子棋啦)》之銘言：
: 你用的是Dig?
: .......我覺得Dig的效率很差ㄝ 為什麼不用isotope勒?
我覺得DIG的system蠻好的耶
靈敏度蠻高的阿
唯一的缺點就是background也很高
不過技術好ㄧ點的話 也是做的出沒有background的data...
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◆ From: 61.229.122.48
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作者 titan50463 (哈) 看板 Biotech
標題 Re: [問題]請問有關northern blot
時間 Mon Nov 29 00:23:46 2004
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我在gel中並沒有放EtBr
而是跑兩片gel
一片做transfer
一片做EtBr stain(RNA量比較少一些)
而hybridization時間那麼短
是因為
我用ambion這家廠商出的hybridization buffer
而ambion protocol上建議 大約2小時就可以了
而roche的protocol有寫只要5micro-gram阿
我本來還想說是不是應該增加RNA的量
這樣HYBRIDIZATION的機率高一些些
而POSITIVE CONTROL沒有耶
我都還沒做出來過
我現在做的都只是測condition
sample都還沒拿來試過
之前我是用roche的整各kit來用
但是我做不出來
所以老師建議我用ambion的hybridization buffer
我今天第一次用他拉.....不過失望了....
我也搞不清楚哪裡出了問題....
請問有用這組roche kit的前輩們
請問你們的blocking buffer還沒加入maleic acid buffer 之前會有結塊現象嗎
還是你們的步驟哪裡跟我不一樣呢?
多謝指教啦.....
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◆ From: 218.34.215.208
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作者 csmceddie (eddie) 看板 Biotech
標題 Re: [問題]請問有關northern blot
時間 Mon Nov 29 00:35:09 2004
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: 所以老師建議我用ambion的hybridization buffer
: 我今天第一次用他拉.....不過失望了....
Roche的hybridization buffer號稱是任何基因
在它的condition下都可以hybrid到的耶
要不然他ㄧ罐賣8000是怎樣.....
: 我也搞不清楚哪裡出了問題....
: 請問有用這組roche kit的前輩們
: 請問你們的blocking buffer還沒加入maleic acid buffer 之前會有結塊現象嗎
blocking buffer是不會結塊的
結塊可能是長菌了
說明書上是說當你blocking buffer打開後就要冰在-20
不然那麼營養的東西 ㄧ下子就會長菌摟
向我之前做的話
dilute過的blocking buffer跟DIG-antibody雖然都會reuse
但是都不會放超過一個禮拜
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◆ From: 61.229.122.48
推 chaowilliam:我都在hood裡面用，以免長菌，並且凍在-80 218.166.212.202 11/29
推 csmceddie:妳有用DEPC treat你的buffer嗎?? 61.229.122.48 11/29
推 titan50463:我有用DEPC-water來泡buffer 218.34.215.208 11/29