Re: [問題] RNAi knock down

[freesoul (尋找生命的出口)]

※ 引述《ad1980 (Apoptosis)》之銘言：
: 不好意思，又是我，本來要跟上面那篇一起的，
: 可是問題好像不太一樣，所以開新的一篇。
: 還有一個問題想請教大家，
: 現在在做 knock-down, 用 pSuper，
: 想請問一下，要多久才能看到knock down 阿？
: 24 hrs 會太短嘛？我看papers 都是3-5 days,
: 但是我想問說通常transfection後，大概多久之後會開始knock-down。
: 還有，我現在做是用immunostaining，然後再用ImageJ量signal intensity，
: 看看有沒有減少，不過這樣感覺好像少了什麼。
: 除了Western blot之外還有其它方法知道到底有沒有成功knock-down 嘛？
: 因為我做RNAi主要是想確定我的Ab 是對的，是specific to my protein，
: 如果intensity 有減少代表Ab沒錯，問題是Ab要很concentrate才能在WB顯現，
: 做WB的話會用掉很多很多Ab....
: 不知道大家通常是怎麼確定有沒有knock down 成功。
: 感謝。
RNAi knockdown要看你的protein half life
所以一些cell cycle相關的可能兩三天效果就出來了
運氣不好做到那種turnover很慢的可能四五天還是看不出來有什麼差
所以三四天是我覺得(假設)什麼都不知道下第一個可以試著抓的時間點

另外用RNAi來確定你Ab的specificity
除非你很確定這個RNAi sequence是真的有用 比如已經是published的
用一個不確定的東西來證明另一個不確定的東西我想不是一個很好的辦法

還有WB需要的Ab量應該比immunostaing少吧?
真的很暗很暗就曝光O/N 再怎樣應該都還是比做immunostaing省Ab說

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 141.214.17.17
→ ad1980:RNAi 其他實驗室用RT-PCR試過了，有用，所以我們拿來試
→ ad1980:蛋白質，看有沒有被抑制，希望證明我們的Ab是對的。
→ ad1980:不過，如果不用RNAi，還有什麼方法可以證明Ab是對的阿？
→ ad1980:一個剛開始被研究的蛋白質，沒有Ab，所以自己做了Ab的話，
→ ad1980:除了RNAi，還有其他方法可以證明自己做的Ab是對的嘛？
→ ad1980:自己先做RNAi，然後用RT-PCR證明有用後，再拿來證明Ab？
→ ad1980:嗯，我會看看能不能試WB，感謝解答。^_____^