※ [本文轉錄自 Biology 看板]
作者: ymyusan () 站內: Biology
標題: [問題] real-time PCR
時間: Sun Dec 12 17:34:06 2004
請教各位前輩:
有人做過real-time PCR 嗎?最近老闆說要confirm data..
拜託我去做做real-time PCR,可是小弟我才進實驗室不到半年...
我目前有看了一些相關的資訊,我應該會選擇SYBR GREEN..
各位前輩可以指導我一下嗎?基於技術成面要求低,精準性高..來選擇的話..
我適合做SYBR GREEN嗎???..
還有一點就是之前學長姐都沒有做過....
有做過real-time PCR 的前輩們,能否提供一些應該注意的地方..
感激不盡~~
例如:書上常提到threshold..小弟不太了解...
對於threshold,小弟的解釋:amplification的時候,可以開始進行quantitative
時的cycle number..然後在將dilute多倍的DNA,以threshold時的cycle number
當作factor,做standard curve...在將target gene做real-time PCR 推出target
gene concentration..不知道這樣的解釋如何??各位前輩請指導一下..
先謝囉~~~
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作者 HIbaby (嗨北鼻) 看板 Biotech
標題 [轉錄]Re: [問題] real-time PCR
時間 Sun Dec 12 20:38:54 2004
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※ [本文轉錄自 Biology 看板]
作者: aggaci (五子棋啦) 看板: Biology
標題: Re: [問題] real-time PCR
時間: Sun Dec 12 20:28:02 2004
※ 引述《ymyusan ()》之銘言：
: 請教各位前輩:
: 有人做過real-time PCR 嗎?最近老闆說要confirm data..
: 拜託我去做做real-time PCR,可是小弟我才進實驗室不到半年...
: 我目前有看了一些相關的資訊,我應該會選擇SYBR GREEN..
: 各位前輩可以指導我一下嗎?基於技術成面要求低,精準性高..來選擇的話..
: 我適合做SYBR GREEN嗎???..
這是最便宜的...若你們實驗室不是非常有錢的話 選這個沒錯
: 還有一點就是之前學長姐都沒有做過....
: 有做過real-time PCR 的前輩們,能否提供一些應該注意的地方..
: 感激不盡~~
我認為最重要的地方在於你使用pipetman的技術
就是要"準"! 每管所加的sample量都必須一樣....
別以為這很簡單...其實很難
: 例如:書上常提到threshold..小弟不太了解...
: 對於threshold,小弟的解釋:amplification的時候,可以開始進行quantitative
: 時的cycle number..然後在將dilute多倍的DNA,以threshold時的cycle number
: 當作factor,做standard curve...在將target gene做real-time PCR 推出target
: gene concentration..不知道這樣的解釋如何??各位前輩請指導一下..
: 先謝囉~~~
threshold 中文是"門檻"的意思
也就是機器所設定的background
其用處在於 當你再進行PCR時 其螢光量會隨著cycle增加而上升
當你的螢光量超過threshold時
此時 的cycle number為Ct value
其表現亮皆由此值來運算
所以你要看的基因表現量越高 <=> Ct value越低
反之 基因表現量越低 <=> Ct value越高
realtime pcr若是使用sybr green有2種方式
絕對定量(absolute quantification)以及 相對定量(relative quantification)
各有優劣
絕對定量較準 但需要較多的sybr green
相對定量省sybr green 但其準確度較差...
http://www.gene-quantification.info/
這個網站當初在我剛做real time pcr時幫我很多
你參考看看
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