不好意思請問一下
我想將一段RNA做RT後 再PCR其cDNA的片段至2kb
可是一直做不成功
我RT的condition是60度1小時 (by Invitrogen)
PCR的program是94度30秒->39度30秒->72度7分(40 cycle) (by GeneMark)
以上的condition我只P出另一個1027bp的片段
可以請各位高手幫我看一下嗎? 有沒有什麼方法可以讓產物做長一點呢?
謝謝啦~~~~~ 拜託拜託^^
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 211.74.86.210
> -------------------------------------------------------------------------- <
發信人: ebiyaya.bbs@nculs.twbbs.org.tw (一筆雅雅), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題] 請問RT-PCR 2kb較好的方法?
發信站: 生生不息 (Sun Mar 20 13:08:51 2005)
轉信站: ptt!Group.NCTU!grouppost!Group.NCTU!nculs
※ 引述《aminoacid72.bbs@ptt.cc (奶油愛掛逼)》之銘言：
> 不好意思請問一下
> 我想將一段RNA做RT後 再PCR其cDNA的片段至2kb
> 可是一直做不成功
> 我RT的condition是60度1小時 (by Invitrogen)
> PCR的program是94度30秒->39度30秒->72度7分(40 cycle) (by GeneMark)
> 以上的condition我只P出另一個1027bp的片段
> 可以請各位高手幫我看一下嗎? 有沒有什麼方法可以讓產物做長一點呢?
> 謝謝啦~~~~~ 拜託拜託^^
我也再做這個實驗
之前聽老師說
RTPCR最重要的是三點:
1.RNA抽完品質要好
2.cDNA要做的好
3.RTPCR的program要設好
我在想
你RT的condition是60度1小時,這應該指的是annealing的溫度和時間吧
溫度會不會太高了些?
我是用42度一個半小時(用AMV reverse transcriptase)
你可以先用別的primer試看看夾出來的RT品質好不好
確定RT有沒有問題
如果沒有問題在做PCR
而且我在想你RTPCR的anneal的溫度會不會太低了些?
39度專一性可能會不夠強,夾出的片段size都是屬於比較小的
一般的annealing temperture 可以設在54到63度之間
你可以試看看
希望你也可以做的出來^^
加油!^^
--
◤◥ Origin: 中央生科˙生生不息 nculs.twbbs.org.tw
◣◢ Author: ebiyaya 從 94-229.dorm.ncu.edu.tw 發表
> -------------------------------------------------------------------------- <
作者: aminoacid72 (奶油愛掛逼) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請問RT-PCR 2kb較好的方法?
時間: Sun Mar 20 14:42:31 2005
※ 引述《ebiyaya.bbs@nculs.twbbs.org.tw (一筆雅雅)》之銘言：
: 我在想
: 你RT的condition是60度1小時,這應該指的是annealing的溫度和時間吧
: 溫度會不會太高了些?
我是聽說用Thermoscript RTase對高溫效果還不錯...
: 我是用42度一個半小時(用AMV reverse transcriptase)
: 你可以先用別的primer試看看夾出來的RT品質好不好
: 確定RT有沒有問題
恩...我有用別的primer夾較短的片段 結果是成功的
不過聽學長說那組primer很容易做出來就是了^^
: 如果沒有問題在做PCR
: 而且我在想你RTPCR的anneal的溫度會不會太低了些?
: 39度專一性可能會不夠強,夾出的片段size都是屬於比較小的
其實是怕溫度太高primer接不上去
我在用的這組primer專一性好像不是很好
: 一般的annealing temperture 可以設在54到63度之間
: 你可以試看看
: 希望你也可以做的出來^^
: 加油!^^
謝謝你囉~~~我會試試看其他溫度的
不過我聽說在做不出產物的時候不是應該降低溫度比較好嗎?
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 211.74.86.210
> -------------------------------------------------------------------------- <
發信人: ebiyaya.bbs@nculs.twbbs.org.tw (一筆雅雅), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題] 請問RT-PCR 2kb較好的方法?
發信站: 生生不息 (Sun Mar 20 23:32:51 2005)
轉信站: ptt!Group.NCTU!grouppost!Group.NCTU!nculs
※ 引述《aminoacid72.bbs@ptt.cc (奶油愛掛逼)》之銘言：
> ※ 引述《ebiyaya.bbs@nculs.twbbs.org.tw (一筆雅雅)》之銘言：
> : 我在想
> : 你RT的condition是60度1小時,這應該指的是annealing的溫度和時間吧
> : 溫度會不會太高了些?
> 我是聽說用Thermoscript RTase對高溫效果還不錯...
> : 我是用42度一個半小時(用AMV reverse transcriptase)
> : 你可以先用別的primer試看看夾出來的RT品質好不好
> : 確定RT有沒有問題
> 恩...我有用別的primer夾較短的片段 結果是成功的
> 不過聽學長說那組primer很容易做出來就是了^^
你可以試試別的primer看看^^
> : 如果沒有問題在做PCR
> : 而且我在想你RTPCR的anneal的溫度會不會太低了些?
> : 39度專一性可能會不夠強,夾出的片段size都是屬於比較小的
> 其實是怕溫度太高primer接不上去
> 我在用的這組primer專一性好像不是很好
> : 一般的annealing temperture 可以設在54到63度之間
> : 你可以試看看
> : 希望你也可以做的出來^^
> : 加油!^^
> 謝謝你囉~~~我會試試看其他溫度的
> 不過我聽說在做不出產物的時候不是應該降低溫度比較好嗎?
還是如果真的做不出來的話
要不要試試重設primer
如果真的做不出來的話啦
加油囉!^^
--
◤◥ Origin: 中央生科˙生生不息 nculs.twbbs.org.tw
◣◢ Author: ebiyaya 從 94-229.dorm.ncu.edu.tw 發表
> -------------------------------------------------------------------------- <
作者: edcc (edcc) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請問RT-PCR 2kb較好的方法?
時間: Tue Mar 22 19:13:09 2005
※ 引述《aminoacid72 (奶油愛掛逼)》之銘言：
: ※ 引述《ebiyaya.bbs@nculs.twbbs.org.tw (一筆雅雅)》之銘言：
: : 我在想
: : 你RT的condition是60度1小時,這應該指的是annealing的溫度和時間吧
: : 溫度會不會太高了些?
: 我是聽說用Thermoscript RTase對高溫效果還不錯...
沒聽說過在高溫下會比較好??可以解釋一下原理或為什麼嗎?
我們實驗室是用42度1小時,你也可以同時參考invitrogen的superscript transcriptase
的使用說明,它上面是寫42度50分鐘. 建議你可以先看一下,再進行實驗,會減少失敗.
: : 我是用42度一個半小時(用AMV reverse transcriptase)
: : 你可以先用別的primer試看看夾出來的RT品質好不好
: : 確定RT有沒有問題
: 恩...我有用別的primer夾較短的片段 結果是成功的
: 不過聽學長說那組primer很容易做出來就是了^^
: : 如果沒有問題在做PCR
: : 而且我在想你RTPCR的anneal的溫度會不會太低了些?
: : 39度專一性可能會不夠強,夾出的片段size都是屬於比較小的
: 其實是怕溫度太高primer接不上去
: 我在用的這組primer專一性好像不是很好
: : 一般的annealing temperture 可以設在54到63度之間
: : 你可以試看看
: : 希望你也可以做的出來^^
: : 加油!^^
: 謝謝你囉~~~我會試試看其他溫度的
: 不過我聽說在做不出產物的時候不是應該降低溫度比較好嗎?
~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
這句話有點問題..根據我的認知,每個primer都有它的最適溫度,
你應該要去找出它的最適溫度,並不是越低溫就一定會出來.
還有建議你可以了解一下一般的primer都設計幾個mer?
一般都18~20多各mers左右,越多mers相對的Tm值越高,
它的專一性也就越高,畢竟沒有人想要夾到不是自己的基因,
廠商在合成primer給你們時,應該同時會附上這組primer的Tm值,
一般來說,是在Tm值的附近試annealing溫度,(當然也有例外).
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.115.48.92