Re: 請問大片段的RT-PCR

[aggaci (有氣質的台客)]

※ 引述《aggaci (有氣質的台客)》之銘言：


   請問一下  最近想釣幾個基因出來作表現
   3個基因PCR出來的片段大小約為1.5 kb
   本來用construct的primer去夾  沒夾到(位置不對，差太多)
   後來再往外設計primer想做nested PCR
   怪的是...那個位置也沒有我想要的band!
   這....看了一下他們序列，發現GC比例還不少
   明天會加DMSO或formamide試試看..............
   想請教大家，有沒有什麼原因會導致PCR沒有產物?
   (是primer dimer的原因嗎?發現我的primer dimer似乎還不少)
   以下是我的條件

   95度  30s
   60度  30s
   72度  100s
   35 cycle

   p.s
   1.cDNA quality不好的原因已去除，因為這是別人給我的cDNA
     他已經檢查過了
   2.我非常確定這個細胞有表現這幾個基因

   唉  第一次做RT-PCR感受到這麼強大的無力感
   難怪有人說RT-PCR是最困難的技術，因為他太簡單了
   簡單到發生問題不知道問題出在哪

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◆ From: 140.114.100.165
※ 編輯: aggaci          來自: 140.114.100.165      (06/08 01:08)
推 meiosisLin:你的CG值有多高？and DMSO加的比率？
  2個60%左右，一個70%
  算高了吧.............
  這幾天一直PCR  P到快瘋了
  其實我有點懷疑
  作RT時會不會根本沒做出來...
  畢竟RT的作用溫度為42度(我用promega的MMLV)
  形成二及結構的機會太高

推 oxoox:如果你的gc值高 應該把前面兩個時間加長到一分鐘以上
  唉 做過了，還是沒用
  我看去借個betaine來試試好了.........冏oz

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◆ From: 140.114.100.165
推 meiosisLin:我做過CG值64%的....DMSO加到7.5~10%..正常值不超過5%
→ meiosisLin:另外...annealing 溫度往下降到58~54之間試試看...
→ meiosisLin:前兩段時間加到一分鐘.....
→ meiosisLin:PS:原始ＤＮＡ序列CG值高家ＤＭＳＯ試試看..兩端primer
→ meiosisLin:ＧＣ值過高也可以用此方試試是看....
推 vixen:RT那個步驟往往是關鍵所在.
推 aggaci:是阿，所以我剛訂了thermoscript，可以在高溫做RT...
推 zanhna:RT primer的選擇也會有差異'