推 cqw80000:新配一片膠試試看! 10/21 16:07
→ U0:沒錯，用現泡的最好 10/21 19:46
推 Realthugz:marker呢 10/21 21:41
→ huuban:樓上..不是每家實驗室都有marker啊..T^T marker很貴啊.. 10/22 01:18
→ huuban:原po的問題重跑就知道了..degrade的RNA也可能有很漂亮的值 10/22 01:19
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作者: pocession (阿宗) 看板: Biotech
標題: Re: [求救] 用舊的agarose gel跑RNA
時間: Sat Oct 22 00:30:58 2011
※ 引述《rockerwei (才女)》之銘言：
: 今天用做了一個禮拜的agarose gel跑RNA
: 結果照膠的時候發現RNA都變成degrade的狀態了
: 不過測O.D.又是正常的
: 請問是不是要run RNA gel最好還是用新的膠run
: P.S.我是早上抽RNA下午跑應該沒有冰凍解凍的問題
根據經驗
如果你的agarose gel做好後，是以密封的方式保存 (E.G 放在保鮮盒)
而且保存用的buffer是乾淨的 (E.G DEPC water)，
跑的時候buffer也是新鮮配製的
那放一個禮拜以上的膠並不會讓sample產生degrade
還有 就算是degrade的RNA也是測得到OD的，OD不代表完整性
不過就像推文說的 還是要跑marker才能判斷妳的情況
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◆ From: 27.51.9.66
→ Realthugz:DNA也是 OD不代表甚麼 跑個膠最實在 10/22 00:56
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作者: rockerwei (才女) 看板: Biotech
標題: Re: [求救] 用舊的agarose gel跑RNA
時間: Sat Oct 22 20:00:38 2011
※ 引述《pocession (阿宗)》之銘言：
: ※ 引述《rockerwei (才女)》之銘言：
: : 今天用做了一個禮拜的agarose gel跑RNA
: : 結果照膠的時候發現RNA都變成degrade的狀態了
: : 不過測O.D.又是正常的
: : 請問是不是要run RNA gel最好還是用新的膠run
: : P.S.我是早上抽RNA下午跑應該沒有冰凍解凍的問題
: 根據經驗
: 如果你的agarose gel做好後，是以密封的方式保存 (E.G 放在保鮮盒)
: 而且保存用的buffer是乾淨的 (E.G DEPC water)，
: 跑的時候buffer也是新鮮配製的
: 那放一個禮拜以上的膠並不會讓sample產生degrade
: 還有 就算是degrade的RNA也是測得到OD的，OD不代表完整性
: 不過就像推文說的 還是要跑marker才能判斷妳的情況
不過我們實驗室也只有用DNA maker來看18s和28s是不是對的
DNA maker跑得很正常
(RNA有特別的maker嗎?)
我們的膠只是單純放在一般的保鮮盒
buffer已經跑到都要不行了
所以還是要用全新的膠全新的buffer來跑會比較好就對了
(因為實驗室check PCR pruduct也都是用舊得膠舊的buffer跑~但band都很正常)
因為在以前的實驗室都是要跑才做膠所以RNA也都是正常的
(而且還有先denature處理過才跑，做的膠有外加ATA)
所以不確定是因為跑舊膠的問題還是沒有經過denature的處理
(現在的實驗室有點窮，所以都沒有處理RNA就直接跑了~)
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◆ From: 220.137.13.206
→ huuban:有RNA marker喔，單股雙股都有，頗貴的... 10/22 20:44
→ Realthugz:膠我都做好泡在buffer放上個把月的... 10/22 22:27
→ Realthugz:如果是看18s 28s我是跑過的 非現做的膠沒問題... 10/22 22:28
→ Realthugz:我是菌液加phenol上清拿去跑 都看得到那兩條喔 10/22 22:30
→ Realthugz:以上主要是跑看有無plasmid 會順便看到18s 28s 10/22 22:32
→ Realthugz:歐 菌應該是 16s 23s 10/22 22:34
→ popopig2000:denature就利用formaldehyde和加溫65度就好了 10/23 00:27
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作者: pocession (阿宗) 看板: Biotech
標題: Re: [求救] 用舊的agarose gel跑RNA
時間: Sat Oct 22 23:27:02 2011
※ 引述《rockerwei (才女)》之銘言：
: ※ 引述《pocession (阿宗)》之銘言：
: : 根據經驗
: : 如果你的agarose gel做好後，是以密封的方式保存 (E.G 放在保鮮盒)
: : 而且保存用的buffer是乾淨的 (E.G DEPC water)，
: : 跑的時候buffer也是新鮮配製的
: : 那放一個禮拜以上的膠並不會讓sample產生degrade
: : 還有 就算是degrade的RNA也是測得到OD的，OD不代表完整性
: : 不過就像推文說的 還是要跑marker才能判斷妳的情況
: 不過我們實驗室也只有用DNA maker來看18s和28s是不是對的
: DNA maker跑得很正常
: (RNA有特別的maker嗎?)
: 我們的膠只是單純放在一般的保鮮盒
: buffer已經跑到都要不行了
: 所以還是要用全新的膠全新的buffer來跑會比較好就對了
: (因為實驗室check PCR pruduct也都是用舊得膠舊的buffer跑~但band都很正常)
: 因為在以前的實驗室都是要跑才做膠所以RNA也都是正常的
: (而且還有先denature處理過才跑，做的膠有外加ATA)
: 所以不確定是因為跑舊膠的問題還是沒有經過denature的處理
: (現在的實驗室有點窮，所以都沒有處理RNA就直接跑了~)
嗯 可能我的意思讓你有點誤解
要跑RNA Marker的原因有兩個
一個是DNA的分子量沒有辦法代表RNA (DNA為雙股，RNA為單股，單體的分子量也不一樣)
另一個是確保你在SAMPLE prepare或是跑膠的過程中RNA沒有分解
(如果跑膠的流程中出錯，RNA marker就會分解了，以此作為判斷)
所以你用DNA marker作比較，是沒辦法作任何判斷的
另外，根據我的經驗，膠的新鮮與否並不是很直接的影響
主要是跟你放置的容器和跑膠的buffer有很大的關係
容器要乾淨，跑膠的buffer儘量滅過菌，然後要跑時再稀釋(要用二次水)，
如果要把RNA sample作變性處理
可以自己配製含formaldehyde的loading buffer就好了，滿便宜的
如果不想買RNA marker，可以自己用acid phenol抽新鮮的大腸桿菌(養至對數期的細菌)
裡面會有5S, 16S, 23S；可以幫助你判斷位置和跑膠流程有沒有發生問題
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◆ From: 27.51.139.248
推 huuban:推這篇!! 10/23 17:09