推 lgirl:sub 1/4 約四天長滿 140.112.206.22 11/25
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作者 Ithilloth (Ithilloth) 看板 Biotech
標題 Re: [問題] cell culture passage
時間 Thu Nov 25 02:24:50 2004
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※ 引述《HIbaby (嗨北鼻)》之銘言：
: 我沒有查
: 不過我的推測是 當細胞成長的狀態 是就較有活性的
: 當細胞長滿 細胞間互相接觸 就會傳遞訊息給對方 不用再長了
: 這時候細胞會處於休止狀態
: 所以繼代之後 細胞因為生長 而具有活力
: 當繼代越久 可能因為分裂次數過多 對細胞本身而言 會越來越失去原來的活力
: 這邊回得不是很科學. 尚待前輩指正
養越多代這株細胞越有可能出問題
除非原本就是cancer cell做出來的strain(無敵殺不死)
雖然cell culture的condition已經盡量講究乾淨不汙染
但是一些很難避免掉的微生物還是有可能長出來 像mycoplasma
為了去掉那些細菌或黴菌在medium裡面加大量的antibiotic
在這種情況下越長期 細胞會發生什麼事就沒有人可以保證了
cell line本來的定義就是這株細胞可以持續poliferation
維持細胞的數量 而特性沒有改變 自己跟下一代是完全一樣的
所以具有這種特性的 大多是上皮細胞
理論上cell line是可以無限制一直生長的
但是為了避免前一段提到的夜長夢多
通常不會解凍一次養很多代
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◆ From: 61.62.95.157
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作者 Lipaty (月餅不要吃太多) 看板 Biotech
標題 Re: [問題] cell culture passage
時間 Thu Nov 25 04:08:24 2004
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※ 引述《ymyusan ()》之銘言：
: 請問各位前輩:
: 如何定義passage呢???...
: 小弟最近在思考cell-line passage之後有什麼特殊意義嗎???
: 代數代表什麼意義/??代數越大,細胞越老化嗎????假如如此有必要一直養細胞嗎???
: trypsin下來的小部份cell-line繼續養下去,這樣跟前一代的cell-line一樣嗎???
: 還是passage只是因為基於食物和空間限制所做的嗎???
: 小弟在此感激不盡~~~~~
1.代數的意義是?
cell-line從最早被generate出來之後就開始在算代數了
分裂一次就是一代 所以一些常用的cell-line
早就不知道幾百萬代了
誠如版友所言 基本上分裂的子代是完全和親代相同的(這樣做實驗才有意義)
但是實際上還是有差異存在 例如telomere的長度
以及基因的位置可能改變等等(位置的改變會影響其表現)
所以在持續subculture(或稱為passage)之後
某種程度上 分裂的子代已經和最初的親代不同了
哪裡不同很難一一說出來 但就是會不一樣 乾脆就稱之為
"change of genomic background"
可以從幾個地方觀察到細胞的改變:
a.繼代的時間改變: 代數越大的細胞 基本上生命力會下降 細胞週期改變
舉例來說 代數小的時候 每次將細胞養到X% confluency後在顯微鏡下觀察
數一數圓起來的細胞(表示正在分裂) 這個數字會隨著代數的增加而慢慢減少
表示隨著繼代次數增加 顯微鏡下觀察到某一瞬間正在分裂的細胞數目會減少
以上是以assychronized的細胞為例
b.morphology的改變: 即使是cell-line(immortalized cell), 也會發生老化現象
一般以為cell-line不會老化是錯誤的觀念 只要是細胞 持續分裂的結果 就是進入
senescent stage; 老化細胞的特徵幾個, enlargement, no cell division,
以及 有些會有多核的現象(顯微鏡下可以觀察 四核到八核甚至16核都有)
如果在繼代的過程發現這樣的細胞變多了 也表示你handle的細胞老了 該重新解凍了
老化的細胞還不會立刻死亡 而會隨著繼代一直留在你的cell population之中
經過一些時間之後才會發生apoptosis(時間長的可以到一兩年)
c.adhesion的改變: adhesion除了發生在cell-substrate或cell-matrix之間
也發生在cell-cell之間. 習慣把細胞養的很滿才繼代的人 一般來說細胞老的比較快
更甚而 某些細胞養太滿的話 會堆疊而形成foci而不再是monolayer
這種改變常常是irreversible的 就是說即使你見狀不妙 趕快分的稀一點
細胞卻再也回不來原本的樣子了 比如說形狀細長化 養不滿 總是有空隙
而且還沒養滿就堆疊 這種irreversible的改變 也是告訴你 該換新細胞啦
養細胞的人常常用"細胞變掉了"來說明觀察到的子代已經不再跟剛開始養的親代
一模一樣了 somehow這意味著genomic background的改變
這個時候再不換細胞 之後的實驗結果 也許會出人意料之外
不過別高興 這可能是artifact 要等換了新細胞再repeat幾次 才知道是不是真的
阿 所以 代數 當然是越小越好啦
(不過這根本沒辦法解決)天曉得你從ATCC買來的細胞是多少代才凍起來的咧?
2.有沒有必要一直養細胞?
這個問題基本上答案是 沒必要
除非你很長一段時間裡頭(比方說碩士兩年) 常常都會用這株細胞來作實驗
不然的話 持續keep culturing是很浪費的行為
medium, serum, 甚至laminar flow的折損, 都是要花錢的阿
而且細胞要有上述的change of genomic background的問題
所以實際的做法是:看情況而言
經常要用到的 就最少一次keep一盤
這次用過就不會馬上再用的 就凍起來
下次要用的時候 再重新解凍 一般剛解凍的細胞要養過兩代再開始作實驗
會比較好 細胞也是要恢復一下 拿剛解凍沒兩天的細胞來作transfection
他會死給你看
3.passage只是因為基於食物和空間限制所做的嗎?
是滴 沒錯 這是最原始要面對的問題 細胞越多 養分銷耗和廢物濃度都上升
空間不足 所以要分盤繼代 這些相信大家都沒有問題
不過 這裡有衍生出來的問題:
有沒有版友碰過某些很難伺候的細胞 不能養太稀也不能養太滿
不然他要不是不長就是搞不好會死掉 或是形狀就變了
就是要剛好給他那個空間 他才會長的好 可是其實那個空間很大
應該還夠他再分裂個幾次再繼代 不過就是不能等
這個要怎麼說?
還有一個例子 就是 能不能一個dish一直用? 就是說把切下來的細胞稀釋以後
再種回去同一個dish裡頭 以期節省petri dish使用量
這樣做是好不好咧? 其實也是看細胞
有些細胞可以 但是有的再種回去 不是貼的不好 就是長得歪七扭八
不然就是會死掉
這個又要怎麼說咧?
上面這兩個 應該是跟cell matrix有關
詳細情形我就不熟悉了 期待有版友分享心得
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作者 oooooo.bbs@bbs.Life.NCTU.edu.tw (都是系統), 看板 Biotech
標題 Re: [問題] cell culture passage
時間 交大生科勁公園 (Thu Nov 25 04:44:54 2004)
轉信 ptt!Group.NCTU!grouppost
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: 還有一個例子 就是 能不能一個dish一直用? 就是說把切下來的細胞稀釋以後
: 再種回去同一個dish裡頭 以期節省petri dish使用量
: 這樣做是好不好咧? 其實也是看細胞
: 有些細胞可以 但是有的再種回去 不是貼的不好 就是長得歪七扭八
: 不然就是會死掉
: 這個又要怎麼說咧?
有些cell line(如PC12)生長的petri dish上面需要鋪上collagen
細胞才能夠黏附在dish上面 不然細胞就會死掉 要不然就是變性
重複使用collagen會被消耗掉, 所以subculture幾次就需要換dish
: 上面這兩個 應該是跟cell matrix有關
: 詳細情形我就不熟悉了 期待有版友分享心得
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作者 oooooo.bbs@bbs.Life.NCTU.edu.tw (都是系統), 看板 Biotech
標題 Re: [問題] cell culture passage
時間 交大生科勁公園 (Fri Nov 26 17:37:45 2004)
轉信 ptt!Group.NCTU!grouppost
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※ 引述《aggaci.bbs@ptt.cc (五子棋啦)》之銘言：
: ※ 引述《boyo (29大頭)》之銘言：
: : 不如自己買fibronetin回來泡
: : 自己coat 便宜多了
: : 之前養mesenchymal stem cell就是要養在fibronectin coated dish上
自己做coating比較麻煩可是也比較便宜，
只要實驗做的出來就好了。
: ㄜ....但是很麻煩
: 上次聽到那個步驟喔 實在是.....麻煩
: 而且我找不到地方賣vitrogen(我要coating vitrogen + fibronectin + BSA)
: ps. 我養支氣管上皮細胞(BEAS-2B)啦
http://www.vitrogen.nl/
http://www.vitrogen.nl/ordering/
Vitrogen 100
(Code 0701/FXP-019) 100 ml 335.00
隨便用網路找的，比collagen還要貴...
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作者 aggaci (五子棋啦) 看板 Biotech
標題 Re: [問題] cell culture passage
時間 Fri Nov 26 18:48:50 2004
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※ 引述《oooooo.bbs@bbs.Life.NCTU.edu.tw (都是系統)》之銘言：
: ※ 引述《aggaci.bbs@ptt.cc (五子棋啦)》之銘言：
: 自己做coating比較麻煩可是也比較便宜，
: 只要實驗做的出來就好了。
: : ㄜ....但是很麻煩
: : 上次聽到那個步驟喔 實在是.....麻煩
: : 而且我找不到地方賣vitrogen(我要coating vitrogen + fibronectin + BSA)
: : ps. 我養支氣管上皮細胞(BEAS-2B)啦
: http://www.vitrogen.nl/
: http://www.vitrogen.nl/ordering/
: Vitrogen 100
: (Code 0701/FXP-019) 100 ml 335.00
: 隨便用網路找的，比collagen還要貴...
其實一開始我也是找到這個網頁
但是似乎沒台灣公司代理商....只好作罷
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◆ From: 140.114.100.165