推 puh1005:記得monocyte只佔PBMC 5~10% 你確定種的PBMC夠多嗎 10/09 08:30
→ puh1005:primary的WBC 2~3天後就快不行了, 7天會不會太久? 10/09 08:32
推 ZUNDERTAKER:所以在沒有加grow factor的情況下 7天太久? 10/09 20:31
有人再養"Human primary macrophages"
我的實驗是想利用一些多醣體刺激macrophages 測其G-CSF產生的量
了解其中可能參予的訊息傳導途徑
首先我的做法是
從human peripheral blood 利用Ficoll的方式 得到PBMC
方法一 畢業學長過去的做法 直接將PBMC種在6 or 12 well culture plate
大約過一到兩小時左右 會有部份細胞貼附在dish上
換medium 將沒有貼的細胞吸掉 剩下貼的細胞就當作Human primary macrophages
大約從分細胞開始約過七天之後 開始做實驗
方法二 得到PBMC後 再利用Magnetic cell sorting(negative selection)的方式
純化分離得到monocyte 再種在6 or 12 well culture plate
一樣過一到兩小時左右 換medium 將沒有貼的細胞吸掉 大約從分細胞開始約過
七天之後paper稱這種為monocyte-derived macrophages
方法三 比較多paper是這樣做 從方法二 由PBMC得到monocyte後 再加入GM-CSF orM-CSF
等grow factor培養約七天後 一樣paper稱這種為monocyte-derived macrophages
我的困擾的地方在 無論我用哪種方法 都會遇到一種問題
就是剛分完細胞種下去的兩三天內 細胞貼附的情況還不錯
但之後 這些貼附的細胞就會不斷的漂起來 等到七天後我想做實驗時
有時候根本貼超少 少到根本無法做實驗... 而且每個well貼的情況還不太一樣
另外不同次貼的狀況也都不太一樣 也就是每次刺激的細胞數都不同 不容易做統計
我大約種1X10(6次方)~3X10(6次方) 不等 使用RPMI-1640,10%FBS
但奇怪的是 之前學長的做法似乎好像可以貼的很多 但問他怎麼做的
他只會說需要給細胞愛.....
而且方法一 因為直接種PBMC 就算貼的細胞內含有macrophage 或是monocyte分化成的
macrophage
難道不會有其他種細胞嗎 Dendrtic cell也會貼?
怎麼樣都養不好..搞了好幾個月了(其實已經半年了..)
有誰有養這樣細胞的經驗的阿
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※ 編輯: ZUNDERTAKER 來自: 220.134.20.69 (10/08 22:24)