※ 引述《hchung (hiflypig)》之銘言：
: ※ 引述《alicialai (Fairy Monster)》之銘言：
: : 骨頭的切片不是很適合用煮的方式,
: : 因為硬度的關係, 即便你脫鈣脫得非常完全,
: : 在切片的時候切到wax and bone交界的時候還是會卡卡的,
: : 這很容易造成一切看不到的連展片後也看不到的小皺摺~
: : 這是造成浮片的主因.. 我那時候已經用到最貴最好的coating玻片,
: : 只要一煮照樣浮..
: : 後來是改用1mg/ml Pronase在37度處理30min就不會浮了,
: : 但是Retrival的方式depends on你的抗體抗原喔,
: : 我那時候從trypsin到用煮的用酸的pepsin用commercial的..
: : 甚麼方法都試過了, 還有paper寫說要用兩種不同的solution (for cartilage)
: : 試試看找一些相關的paper, 應該可以找到作者群是用哪種方式的囉~~
: : 加油~
: 那我可以再問細節一點的問題嗎?
: 1.你用1mg/ml pronase處理過 還需要用煮的方法做antigne retrieval嗎?
: 2.我後來其實有用acetone加H2O2去做antigen retrieval (某篇paper寫的)
: 然而我很懷疑這樣真的能夠retrieval~雖然我染出來感覺有點出來。
: 但是真的好淡好淡
: 想問A大用的方法染出來就會很明顯嗎?
: 3.另外就是我的脫鈣用的是commercial 的脫鈣液，並不是自己泡的EDTA，
: 不知道這樣會不會影響貼片呢?因為大部分的paper是寫EDTA脫鈣?
: 最後 很感謝A大~我以為這篇文章應該就會被埋沒起來了~結果又來了一道曙光
: 希望這次真的能夠克服掉片問題~
Hey there, 抱歉回晚了,
嘛~~~ 首先~~ 我不是A大, 我只是個在science中載浮載沉的小學生XDDD~
1. after pronase處理之後就上blocking囉, 沒有再煮了~~
2. Acetone這個方法我沒有試過捏, 但那個比較像是硬骨切片的處理方式(樹酯包埋),
而且我有點doubt那是antigen retrival嗎?
因為anitgen retrival的原理是將在脫臘包埋時,
因為浸入有機溶劑或因為石蠟高溫而失活或是被蓋住的antigen呈現出來,
所以才會用enzyme(trypsin, pepsin, protease or pronase),
或是煮(citrate buffer)的方式, 但acetone似乎沒有類似的功能,
而且您說是combine H2O2, 這比較像是去endogenous peroxidase的步驟喔.
(若有錯誤請指正, 感謝喔^___^)
我那時候是染骨組織中的內皮細胞, 也就是血管的部分,
Pronase我染出來非常明顯, 但我前一篇也說囉,
it depends on your antigen,
那時候我同事用我的方法去染軟管(type II or type X collagen)就沒用.
3. commercial的脫鈣液, 呃~~~ 不會是含fomic acid的吧, 如果是, 那就有問題了,
能請問您一次脫鈣大約多久? 有大部分的抗體是只能用EDTA脫鈣的喔, Fomic acid會
破壞antigen, 所以大部分IHC只傾向用EDTA脫鈣, 但壞處就是EDTA脫鈣很耗時間~
希望有幫到您的忙, 有問題的話在互相討論囉^___^~
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 210.50.33.173