※ 引述《alicialai (Fairy Monster)》之銘言：
: ※ 引述《hchung (hiflypig)》之銘言：
: : 那我可以再問細節一點的問題嗎?
: : 1.你用1mg/ml pronase處理過 還需要用煮的方法做antigne retrieval嗎?
: : 2.我後來其實有用acetone加H2O2去做antigen retrieval (某篇paper寫的)
: : 然而我很懷疑這樣真的能夠retrieval~雖然我染出來感覺有點出來。
: : 但是真的好淡好淡
: : 想問A大用的方法染出來就會很明顯嗎?
: : 3.另外就是我的脫鈣用的是commercial 的脫鈣液，並不是自己泡的EDTA，
: : 不知道這樣會不會影響貼片呢?因為大部分的paper是寫EDTA脫鈣?
: : 最後 很感謝A大~我以為這篇文章應該就會被埋沒起來了~結果又來了一道曙光
: : 希望這次真的能夠克服掉片問題~
: Hey there, 抱歉回晚了,
: 嘛~~~ 首先~~ 我不是A大, 我只是個在science中載浮載沉的小學生XDDD~
: 1. after pronase處理之後就上blocking囉, 沒有再煮了~~
: 2. Acetone這個方法我沒有試過捏, 但那個比較像是硬骨切片的處理方式(樹酯包埋),
: 而且我有點doubt那是antigen retrival嗎?
: 因為anitgen retrival的原理是將在脫臘包埋時,
: 因為浸入有機溶劑或因為石蠟高溫而失活或是被蓋住的antigen呈現出來,
: 所以才會用enzyme(trypsin, pepsin, protease or pronase),
: 或是煮(citrate buffer)的方式, 但acetone似乎沒有類似的功能,
: 而且您說是combine H2O2, 這比較像是去endogenous peroxidase的步驟喔.
: (若有錯誤請指正, 感謝喔^___^)
: 我那時候是染骨組織中的內皮細胞, 也就是血管的部分,
: Pronase我染出來非常明顯, 但我前一篇也說囉,
: it depends on your antigen,
: 那時候我同事用我的方法去染軟管(type II or type X collagen)就沒用.
: 3. commercial的脫鈣液, 呃~~~ 不會是含fomic acid的吧, 如果是, 那就有問題了,
: 能請問您一次脫鈣大約多久? 有大部分的抗體是只能用EDTA脫鈣的喔, Fomic acid會
: 破壞antigen, 所以大部分IHC只傾向用EDTA脫鈣, 但壞處就是EDTA脫鈣很耗時間~
: 希望有幫到您的忙, 有問題的話在互相討論囉^___^~
終於等到你上線了.......^^
1.那可以問你買的 pronase的廠商以及貨號嗎？我查了sigma 跟辜狗大神有發現幾
家，但是我還是不知道要買哪家的？
不過要在買之前，還是要先問你怎麼查到底適不適合我的抗體呢？BTW我要染的是
骨頭上面的細胞，Osteocalcin 跟cathepsin k。
2.我發現我講錯了>''<，那篇paper是用methanol加上H2O2(paper寫的，for antigen
retrieval )，不過染出來就是非常淡...幾乎看不見，不過很神奇的是那篇paper
的圖還可以看到細胞就是了>_<。
3.另外呢~我的脫鈣液是買日本試藥的decalcifier(rapid)，這個脫鈣非常快，
一個禮拜就差不多了。但是他的藥品的詳細資料我查不太到，是病理科用的，
我會再查查他的成分的，因為我目前用一種acid phosphatase leukocyte kit，
完全沒有辦法染出來，讓我開始懷疑他的成分。大部分的paper是用EDTA脫鈣，
所以我猜脫鈣液可能要再找找。
4.另外可以問你EDTA的泡法嗎？大概脫鈣多久？condition是如何？
我目前有看到有人用14% 10% 20%脫鈣時間則很少人寫，
pH有7.4或8的。
麻煩你了~
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